Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l'homme pré-ARNm

Summary

En raison de la nature transitoire de pré-ARNm, il peut être difficile d'isoler et d'étudier

Abstract

Séquençage ARN que la co-immunoprécipitation (co-IP) avec protéines liant l'ARN a amélioré notre compréhension de l'épissage en démontrant que l'emplacement contraignante influence souvent fonction d'un facteur d'épissage. Cependant, comme toute stratégie d'échantillonnage les chances d'identifier un ARN lié à un facteur d'épissage est proportionnelle à son abondance cellulaire. Nous avons développé une nouvelle approche in vitro pour l'arpentage spécificité de liaison sur les autres transitoires pré-ARNm. Cette approche utilise un bassin spécialement conçu oligonucléotidiques que les carreaux dans les introns, des exons, jonctions d'épissage, ou d'autres pré-ARNm. La piscine est soumis à une sorte de sélection moléculaire. Ici, nous démontrons la méthode par séparation des oligonucléotides en une fraction liée et non liée et d'utiliser une stratégie à deux couleurs ensemble pour enregistrer l'enrichissement de chaque oligonucléotide dans la fraction liée. Les données du tableau génère cartes à haute résolution avec la possibilité d'identifier des séquences spécifiques et structurelles des déterminants ribonucléoprotéines (RNP) liant pré-ARNm. Un avantage unique de cette méthode est sa capacité à éviter les biais d'échantillonnage en direction ARNm associés à la PI et techniques actuelles SELEX, comme la piscine est spécifiquement conçu et synthétisé à partir de pré-ARNm séquence. La flexibilité de la piscine oligonucléotide est un autre avantage puisque l'expérimentateur choisit les régions à l'étude et la tuile à travers, en adaptant la piscine à leurs besoins individuels. En utilisant cette technique, on peut doser l'effet des polymorphismes ou des mutations sur la liaison à grande échelle ou d'un clone de la bibliothèque dans une journaliste épissage fonctionnels et d'identifier des oligonucléotides qui sont enrichis dans la fraction incluse. Ce roman in vitro de haute résolution schéma de mappage offre un moyen unique d'étudier les interactions avec les RNP transitoires pré-ARNm espèces, dont la faible abondance les rend difficiles à étudier avec cours techniques in vivo.

Protocol

Piscine de conception et oligo récupération

1. La première étape consiste à concevoir la piscine pré-ARNm d'être étudiée. Cela peut être fait en utilisant le navigateur de génome UCSC et le téléchargement de certains gènes, jonctions d'épissage, ou d'autres domaines d'intérêt.
2. Une fois que les fenêtres d'intérêt ont été sélectionnées, les carreaux à travers eux de calcul utilisant les conditions suivantes: longueur de lecture devrait être de 30 nucléotides avec un nucléotide 10 se chevauchent, donc chaque oligo est décalée 20 nucléotides de l'un préalable. * Chevauchent Oligo devrait être augmenté à proximité des sites d'épissage pour assurer une couverture adéquate; augmenter le chevauchement de 10 à 20 nucléotides peuvent accomplir cette tâche.
3. Flanc chaque oligo-nucléotides 30 avec des séquences d'amorces universelles, qui sera utilisé pour amplifier l'aval de la piscine. Carrelé commandes oligo devrait être soumis à Agilent, où les séquences seront imprimées sur une puce oligonucléotidique personnalisés.
4. Pour récupérer les oligos ADN de la surface puces commence par placer la lamelle tableau dans une chambre d'hybridation tableau et en douceur de pipetage 500 ul de dH ₂ O sur la lame
5. Sandwich du tableau sur le dessus de la lamelle, en prenant soin d'éviter les bulles d'air qui peuvent perturber le processus. Veillez à placer le visage large bas que le côté avec les oligos est de toucher la surface de l'eau. Une bonne règle de base est «Agilent Agilent touche" ce qui signifie que l'étiquette Agilent sur le tableau des visages du label Agilent sur la lamelle
6. Fermer la chambre d'hybridation et faire tourner la nuit à 99 ° C dans une étuve
7. Le lendemain, retirez soigneusement le tableau de la chambre et retirez l'eau, qui contient maintenant les oligos libéré de la surface de tableau. C'est la piscine oligo
8. Placez la piscine dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et soniquer la piscine à une amplitude de 50% pour les 3-5 secondes impulsions
9. Ensuite, d'amplifier la piscine par cycle de faible PCR, en utilisant les amorces universelles avec une étiquette T7 ajouté à la fin. Pour le premier tour, dénaturer à 94 ° C pendant 1 minute, recuit à 55 ° C pendant 20 secondes, et allongé pendant 1 minute à 72 ° C. Pour les tours suivants, faire 10 secondes, 20 secondes et 10 secondes à chaque température respectifs, avec une étape d'élongation finale de 5 minutes à 72 ° C. Parce que le nombre de cycles nécessaires pour amplifier la piscine dépend de l'efficacité de la récupération d'oligo, il peut être nécessaire d'essayer plusieurs numéros de cycle. Soyez prudent de ne pas trop amplifier la piscine, qui est signifié par une bande enduite sur un gel d'acrylamide. Amplifié par PCR des échantillons peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
10. La dernière étape de la préparation d'oligo est de transcrire l'ARN en utilisant le kit MEGAshortscript ™ d'Ambion. * Le protocole suivant a été adapté à partir Ambion
    1. Décongelez le tampon de réaction 10X T7, quatre solutions ribonucléotide et de l'eau à température ambiante tout en gardant le mélange enzymatique T7 sur la glace
    2. Assemblez le mélange réactionnel dans un tube à centrifuger sans RNase à la température ambiante. Composantes de la mémoire tampon de réaction peut provoquer l'ADN matrice pour précipiter si la réaction est mélangé sur la glace.
    3. Dans l'ordre suivant, pipette 3 uL eau sans nucléase, 2 pl de tampon de réaction 10x, 2 pl de chaque solution à 75 mM NTP, 5 uL d'ADN matrice (la PCR amplifié piscine oligo) et 2 ul de T7 enzyme, un volume final de 20 pl
    4. Flick délicatement le tube pour mélanger la réaction a ensuite brièvement de centrifugeuse pour recueillir le mélange au fond du tube.
    5. Incuber la réaction dans un thermocycleur à 37 ° C pendant 2 heures. Le temps d'incubation sera de modèle-dépendant, donc il peut être nécessaire d'utiliser une expérience du temps de cours pour déterminer le temps d'incubation optimal pour un rendement maximal
    6. Après 2 heures, retirer la matrice d'ADN en ajoutant 1 pl de Turbo DNase à la réaction et incuber à 37 ° C pendant 15 minutes supplémentaires
    7. Terminer la réaction et la récupération de l'ARN par extraction au phénol / chloroforme et précipitation à l'éthanol.
       1. Pour un volume de 20 uL de réaction, ajouter 115 ul de dH ₂ O et 15 uL d'acétate de sodium 3 M pour la réaction.
       2. Bien mélanger, puis ajouter 75 ul de phénol et 75 uL acide de chloroforme. Mélanger la solution au vortex, puis centrifuger pendant une minute à 13000 rpm à température ambiante. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube et répéter l'extraction
       3. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube et ajouter 150 ul de chloroforme. Vortex, le mélange et centrifugation comme avant. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube.
    8. Récupérer l'ARN en ajoutant deux volumes d'éthanol froid à 100% pour la couche aqueuse et bien mélanger. Réfrigérer le mélange pendant un minimum de 15 minutes à -20 ° C puis centrifuger à 4 ° C pendant 15 minutes à vitesse maximale pour obtenir un culot d'ARN. Retirer délicatement le surnageant et resuspendre le culot dans 105 ul de 0,1 x Tris-EDTA (TE) Tampon ..
11. Il est difficile de retirer tous les nucléotides libres provenant de la réaction kit T7, donc pour des résultats plus précis, de quantifier l'ARN en utilisant RiboGreen.
    1. Pour commencer la quantification, diluer d'abord assez 1x TE, 2300 uL + 50μL/sample.
    2. Ensuite, faire le RiboGreen. Vous aurez besoin de 1 000 uL + 50 uL / ​​échantillon. Pour les échantillons de haute gamme (1 pg / ml à 20 ng / ml) de mélange du 1:200 RiboGreen en 1x TE; pour les échantillons de gamme basse (50 ng / mL à 1 ng / ml) de mélange de l'1:2000 RiboGreen en 1x TE ; Pipeter 50 uL de solution RiboGreen dans chaque puits d'une plaque opaque, en commençant par A1 et le déplacement vers le bas, non pas à travers
    3. Diluer une solution stock d'ARN à 2 ug / ml pour les échantillons de haute gamme ou 100 ng / uL pour les échantillons de basse gamme
    4. En utilisant les solutions mères, de créer une courbe standard par six ultérieures 01:02 dilutions de l'original 2 pg / ml ou 100 ng / mL de stock; Pipeter 240 uL du stock dans un tube de la bande de PCR. Dans les 7 autres tubes, pipettes 120 ul de TE 1x. Prenez 120 uL dans le stock d'ARN ainsi, et mélanger avec le tube 2. Prenez 120 uL du tube 2 et mélanger avec le tube 3. Répétez jusqu'à ce que le tube 7. Tube 8 n'aura TE et sera votre vide. Pipeter 50 uL de la courbe standard des solutions dans la plaque opaque, A1: H2 (courir la courbe deux fois)
    5. Dans un nouveau tube, mélanger 45 ul de TE avec 5 pi de la piscine et ajouter tous les oligo uL 50 à un puits qui contient 50 uL de RiboGreen.
    6. En utilisant un lecteur de plaques régler la machine pour lire la fluorescence par le haut, après un mélange d'une minute avec une longueur d'onde d'excitation de 485 nm et longueur d'onde d'émission de 530 nm et lire la plaque
    7. Utilisez la courbe standard générée à quantifier l'ARN récupérés, ce qui doit être conservé à -20 ° C.

Co-immunoprécipitation de la piscine avec un oligo RNP d'intérêt

1. Avant de commencer le co-immunoprécipitation, préparer la protéine A et protéine G Dynabeads chez Invitrogen en les mélangeant dans un rapport 1:1 jusqu'à un volume final de 50 ul par réaction. Par exemple, pour deux réactions, vous devez ajouter 50 ul de chaque de chaque bille.
2. Utilisez un stand séparation magnétique comme celui de Novagen de tenir les billes en place pendant que vous retirez le surnageant et laver les billes de deux fois avec un volume égal de PBS 1x froide
3. Après le second lavage, remettre en suspension les perles dans un volume égal de PBS 1x froide et ajouter 2 ng de l'anticorps par réaction. Ce montant peut varier en fonction de l'anticorps, donc l'expérimentation est nécessaire de trouver les conditions optimales.
4. Incuber le mélange d'anticorps / perle nuit à 4 ° C sur une plateforme rotative
5. Dans la matinée, ajouter 2 ug par réaction de l'ARN total soniqué la levure de bloquer la liaison non spécifique, et tourner pendant 30 minutes supplémentaires à 4 ° C.
6. Utiliser la grille magnétique pour maintenir les perles, éliminer le surnageant et laver deux fois avec les perles froides 1x PBS, laissant le PBS à partir du second lavage dans le tube.
7. Sortez de nouveaux tubes, un pour chaque réaction et aliquote de 50 uL du mélange billes dans chaque tube. Laissez les billes de siéger pendant la préparation d'un master mix
8. Pour chaque réaction ajouter 200 ng de la piscine oligo, un rapport équimolaire des amorces de protection, 2 pg d'ARN de levure soniqué totale, 20 ul de cellules HeLa nucléaires extrait (c'est la source RNP), et E de tampon pour porter le volume jusqu'à 120 ul. Les amorces de protection sont des versions d'ARN de l'amorce universelle. Modèles de transcription Ordre des amorces universelles avec une étiquette T7 ajouté à la fin, puis transcrire l'ARN à partir des modèles utilisant les MEGAshortscript ™ Kit.
9. Retirer le surnageant de la perle et perles aliquotes remettre en suspension dans 120 uL du mélange maître. Rocher des réactions à 4 ° C pendant 1-2 heures.
10. Après l'incubation, pour chaque réaction, enlever une petite aliquote (y compris les perles) pour une "totale" de l'échantillon d'ARN
11. Placer le reste des réactions sur la séparation magnétique stand et retirer le surnageant. Bien qu'il n'est pas nécessaire d'analyser ce flux continu en aval de l'échantillon, il peut être utile pour enregistrer.
12. Laver les billes 1-2 fois avec 50 ul de PBS 1X froid. L'ARN lié à l'anticorps sur les billes est la "propriété intellectuelle" de l'échantillon.
13. Reprendre le «total» et la «propriété intellectuelle» des perles dans 50 ul de SDS à 1% en 0,1 x tampon TE et chauffer les échantillons à 65 ° C pendant 15 minutes pour éluer l'ARN.
14. Retirer le surnageant, qui contient maintenant de l'ARN qui était auparavant lié aux billes et nettoyer par extraction au phénol / chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol. Sécher les granulés et remettre en suspension dans 50 pl de tampon 0,1 x TE.

La transcription inverse et l'amplification de la co-IP dans la préparation des échantillons pour l'étiquetage aminoallyl

1. Ensuite, les échantillons d'ARN doit être une transcription inverse et amplifié par PCR. Pour la réaction de transcription inverse, utiliser les amorces reverse universelle.
2. Pour chaque échantillon, commencez par mélanger 1 pl del'amorce reverse universel, avec 1 pi de l'ARN modèle (à partir de la réaction d'immunoprécipitation) et 10 pi de dH ₂ O. Chauffer les réactions à 70 ° C pendant 5 minutes puis réfrigérer sur la glace ou conserver à 4 ° C.
3. Bien que les échantillons frais, faire le master mix suivant. Pour chaque réaction combiner 4 ul de 10 mM de dNTPs, 2 pl de tampon 10x Arrayscript, 1 inhibiteur de RNase uL, et une enzyme de transcription inverse uL. Bien mélanger et ajouter 8 uL du mélange maître à chaque réaction de transcription inverse.
4. Utiliser une machine à PCR à incuber les échantillons à 42 ° C pendant 2 heures, suivie par 95 ° C pendant 5 minutes, puis 4 ° C jusqu'à les échantillons sont nécessaires pour l'amplification.
5. Après transcription inverse de l'ARN des échantillons, les amplifier par PCR utilisant des amorces universelles, avec l'une des amorces contenant une étiquette T7. Le nombre de cycles nécessaires pour amplifier la piscine dépendra de l'efficacité de la co-propriété intellectuelle de sorte qu'il peut être nécessaire d'essayer plusieurs cycles. Chaque réaction nécessite 5 uL de tampon de réaction 10x Taq, 0,2 ul de chaque amorce (100 mm), 1 uL de la matrice d'ADNc (à partir de la réaction de transcription inverse), 1 pl de 10 mM de dNTPs, 42,2 ul de dH ₂ O, et 0,4 uL d'enzyme Taq.
   
   Commencez la PCR en incubant les échantillons à 94 ° C pendant 3 minutes. Ensuite, pour chaque cycle, les dénaturer à 94 ° C pendant 45 secondes, recuit à 55 ° C pendant 30 secondes, et allongé à 72 ° C pendant une minute, avec une élongation finale à 72 ° C pendant 10 minutes.
6. Ensuite, transcrire les échantillons à l'aide du kit MEGAshortscript ™, cependant, ce temps, ajouter 2 pi de aminoallyl UTP, au lieu de l'UTP T7. L'UTP aminoallyl sera utilisée pour l'étiquette de l'ARN avec des colorants Cy.
7. Phénol / chloroforme et l'éthanol précipiter les échantillons. NE PAS utiliser Glycoblue ou l'acétate d'ammonium, qui tous deux peuvent interférer avec l'hybridation des échantillons dans le tableau. Sécher les granulés et les remettre en suspension dans 4,5 ul de 0,1 M de carbonate de sodium.

Amino-allyle étiquetage de l'ARN avec des colorants Cy

1. Pour commencer le protocole d'étiquetage dissoudre chacun des colorants fluorescents, Cy3 et Cy5, dans 45 ul de DMSO. Afin d'éviter la lumière, enveloppez les tuyaux dans du papier aluminium et conserver à -20 ° C dans l'obscurité
2. Ajouter 2,5 pi de eau sans nucléase à l'ARN des échantillons et bien mélanger
3. Ensuite, ajoutez 3 ul de Cy3 à la "totale" de l'échantillon, et 3 pl de Cy5 à la «propriété intellectuelle» de l'échantillon. Incuber les échantillons dans l'obscurité pendant 1 heure à température ambiante; L'échantillon Cy-3 s'allume en rouge ou en rose alors que le Cy-5 deviendra bleu.
4. Pour terminer la réaction, ajouter 6 uL de 4 M d'hydroxylamine-HCl à chaque échantillon, mélanger soigneusement et centrifuger brièvement. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
5. Purifier les échantillons étiquetés par extraction au phénol / chloroforme suivie d'éthanol précipitations et resuspendre le culot dans 50 ul de 0,1 x TE

Hybrider échantillons à la puce en utilisant le kit d'hybridation Agilent tableau

1. Commencez par l'hybridation mélangeant doucement 50 ul de tampon de blocage 10x, 140 ul de sans nucléase H2 _O, 25 ul de la Cy3-étiquetés «total» de piscine, 25 ul de la Cy5-étiquetés "IP" piscine, 10 pl de la mémoire tampon de fragmentation 25x et 250 ul de tampon d'hybridation 2x, en prenant soin d'éviter d'introduire des bulles. Microfuge l'échantillon brièvement pour ramasser la solution dans le fond du tube et aussi pour réduire les bulles.
2. Placer la lamelle o-ring dans la chambre d'hybridation et soigneusement la pipette la solution sur la lame.
3. Placez la barrette de détection sur le dessus de la lamelle de «sandwich» de la solution. N'oubliez pas d'orienter la lame large de sorte que l'étiquette Agilent sur le tableau des visages du label Agilent sur la lamelle.
4. Pince le sandwich glisser / tableau dans la chambre d'hybridation et de rotation à 50 ° C pendant 3 heures.
5. Alors que le tableau est en rotation, faire le 50 solutions suivantes ml dans 50 ml tubes coniques: un cône rempli de 50 ml de dH ₂ O, deux solutions tampon 1x CSC, chacun dans un tube séparé, et un 2x CSC tampon.
6. Après l'incubation de trois heures, soigneusement débrider le sandwich tableau / diapositives et la placer dans le cône de 50 ml contenant le tampon 2x CSC. En utilisant une paire de pinces, doucement séparer le tableau à partir de la lamelle et tirez la lamelle. Soyez prudent de ne pas toucher le tableau de la diapositive est tirée. Fermez la conique et retourner doucement pendant 60 secondes.
7. Utiliser les pinces, transférer le tableau à la solution 1x CSC, capuchon du tube, et retourner doucement pendant 1 minute puis transférer le tableau pour la seconde solution 1x CSC et encore retourner doucement pendant une minute.
8. Enfin, le transfert du tableau pour le tube de DH ₂ O et retourner doucement pendant 30 secondes.
9. Sécher le tableau en plaçant les bords de la lame sur une Kimwipe. Continuez à tourner le tableau sur la lingette en veillant à ne pas perturber le côté contenant des oligos.
10. Placez le tableau secun vide de 50 ml tube conique et de numérisation avec un scanner Microarray

Interprétation des biopuces

1. Le scanner biopuces va créer une image TIF du tableau. Exécutez cette image à travers le logiciel Agilent Feature Extraction, en utilisant le fichier de grille (fourni par Agilent) qui est unique à votre piscine spécifiques.
2. Le logiciel Agilent va interpréter le signal à chaque fonctionnalité pour créer un fichier, qui est analysée avec un script Perl. Le signal à chaque fonction est de normaliser l'intensité totale à ce canal. Par exemple à une fonction particulière dans le canal vert, l'intensité de la voie verte pour la caractéristique individuelle est divisée par l'intensité totale du canal vert sur toutes les fonctionnalités. Le résultat final est le logarithme du rapport du canal rouge sur le canal vert à chaque élément sur le tableau.
3. Le pool de données de la puce oligo peuvent être re-mappé vers le génome d'obtenir une image de l'endroit où, et avec quelle force, le RNP d'intérêt lié.

Figure 1. Schéma expérimental

A. Carrelage régime. Après la sélection et le téléchargement de séquences pré-ARNm d'intérêt, la zone de sélection est carrelé travers les fenêtres dans 30 nucléotides qui déplacent par incréments de 10 nucléotides. Universal apprêt flanc sites de liaison de chaque côté de la fenêtre.

Tableau B. Synthèse. Carrelé commandes oligo devrait être soumis à Agilent, où les séquences seront imprimées sur une puce oligonucléotidique personnalisés.

C. Co-immunoprécipitation. Après l'ébullition de l'oligos hors du tableau, incuber dans HeLa extrait nucléaire, puis ajouter l'extrait à des billes magnétiques qui sont préparés avec un anticorps contre le RNP d'intérêt. Étiquette de la piscine oligo commençant par Cy3 et la piscine liée IP avec Cy5 et s'appliquent à l'ensemble de détection et d'analyse.

Figure 2. L'annotation du génome avec et analyse des données de l'enrichissement.

A. Convertissez le score moyen à chaque coordonnée génomiques à partir des données de tableau à base dix journaux et cartographier ce score aux coordonnées données. Une illustration de cette étape de la moyenne est donnée pour 3 chevauchement de 30 nt oligos avec des scores de 2, 4 et 0.5, où le score moyen de l'enrichissement pour chaque fenêtre de 10 nt est représenté graphiquement ci-dessus. Les régions génomiques sélectionnées peuvent être visualisées en utilisant une piste personnalisées dans l'Explorateur de Génome USCS. La fenêtre du navigateur exemple donné est dans le gène de la CLTA, où les caractéristiques du gène (exons / introns / épissage alternatif etc) sont donnés sur le fond et les scores log enrichissement moyen de la oligos PTB-liés sont représentés par des barres verticales rouge foncé. TBP se lie fortement juste en amont de l'exon 2 dans le tractus polypyrimidine.

Discussion

Lorsque vous effectuez cette procédure il est important de se rappeler que la création de la piscine est flexible et ouverte à la modification que ce soit au niveau de l'ARN ou de protéines. Au niveau de l'ARN régions orthologues, les mutations des maladies, des polymorphismes ou des mutations aléatoires peuvent être introduites dans la séquence oligonucléotidique. Au niveau protéique de l'ARN facteur de liaison peut être modifiée par phosphorylation ou d'autres modifications post traductionnelles. De plus, l'environnement contraignantes peuvent être manipulés pour augmenter ou diminuer les niveaux de facteurs supplémentaires qui interagissent ou en compétition avec l'ARN protéine de liaison d'intérêt.