Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Summary

Debido a la naturaleza transitoria de la pre-ARNm, que pueden ser difíciles de aislar y estudiar

Abstract

Secuenciación ARN que co-immunoprecipitate (co-IP) con las proteínas de unión a ARN ha aumentado nuestra comprensión de empalme mediante la demostración de que la ubicación de unión a menudo influye en la función de un factor de empalme. Sin embargo, como con cualquier estrategia de muestreo la posibilidad de identificar un ARN unido a un factor de empalme es proporcional a su abundancia celular. Hemos desarrollado un nuevo enfoque in vitro para la topografía especificidad de unión de otra manera transitoria pre-mRNA. Además, utiliza un conjunto específicamente diseñado oligonucleótidos que los azulejos a través de los intrones, exones, los cruces de empalme, o pre-mRNA. La piscina está sometido a algún tipo de selección molecular. Este sentido, demuestran el método por el que separa el oligonucleótido en una fracción unido y sin unir y utilizar una estrategia de dos colores matriz para registrar el enriquecimiento de cada oligonucleótido en la fracción unida. El conjunto de datos genera mapas de alta resolución con la capacidad de identificar la secuencia específica y estructurales determinantes de la ribonucleoproteína (RNP) de la unión de pre-mRNA. Una ventaja única de este método es su capacidad para evitar el sesgo de muestreo hacia el ARNm relacionados con IP y técnicas actuales SELEX, ya que la piscina está específicamente diseñado y sintetizado a partir de la secuencia pre-mRNA. La flexibilidad de la piscina de oligonucleótidos es otra ventaja, ya que el investigador elige qué regiones de estudio y el azulejo en todo, la adaptación de la piscina para sus necesidades individuales. Usando esta técnica, se puede ensayo de los efectos de los polimorfismos o mutaciones en la unión a gran escala o la clonación de la biblioteca en un reportero de empalme funcionales e identificar los oligonucleótidos que se enriquecen en la fracción incluidos. Esta novela in vitro de alta resolución esquema de mapeo ofrece una forma única para estudiar las interacciones con RNP transitoria pre-ARNm especies, cuya baja abundancia hace difícil su estudio con las actuales técnicas in vivo.

Protocol

Piscina de diseño y recuperación de oligo

1. El primer paso es el diseño de la piscina pre-mRNA en estudio. Esto se puede hacer uso de la UCSC Genome Browser y la descarga de determinados genes, los cruces de empalme, o otras áreas de interés.
2. Una vez que las ventanas de interés han sido seleccionados, el azulejo a través de ellos computacional usando las siguientes condiciones: longitud lectura debe ser de 30 nucleótidos con una superposición de 10 nucleótidos, por lo tanto, cada oligo se desplaza 20 nucleótidos de la anterior. * Superposición Oligo se debe aumentar en la proximidad de los sitios de empalme para asegurar una cobertura adecuada, el aumento de la superposición de 10 a 20 nucleótidos puede lograr esto.
3. Flanco cada oligo de 30 nucleótidos con secuencias de los cebadores universales, que se utiliza para amplificar la corriente abajo de la piscina. Azulejos órdenes oligo deben presentarse a Agilent, donde las secuencias se imprimirá en un microarray de oligonucleótidos personalizado.
4. Para recuperar los oligos de ADN de la superficie de microarrays comenzará a colocar la tapa deslizante matriz en una cámara de hibridación amplia y suavemente pipeteando 500 l de dH ₂ O en la diapositiva
5. Sandwich de la matriz en la parte superior de la tapa deslizante, teniendo cuidado de evitar las burbujas de aire que puede interrumpir el proceso. Asegúrese de colocar el rostro hacia abajo de modo conjunto el lado de los oligos está en contacto con la superficie del agua. Una buena regla de oro es "Agilent Agilent toca" lo que significa que la etiqueta de Agilent en la matriz se enfrenta a la etiqueta de Agilent en la tapa deslizante
6. Cierre la cámara de hibridación y girar toda la noche a 99 ° C en un horno de hibridación
7. Al día siguiente, retire con cuidado la matriz de la cámara y extraiga el agua, que ahora contiene los oligos liberado de la superficie de la matriz. Esta es la piscina oligo
8. Lugar de la piscina en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y sonicar la piscina a 50% de la amplitud de los pulsos 5.3 segundos
9. A continuación, ampliar la piscina por el bajo número de ciclos de PCR, utilizando los cebadores universales con una etiqueta de T7 se añade al final. Para la primera ronda, se desnaturalizan a 94 º C durante 1 minuto, recocido a 55 ° C durante 20 segundos, y se alargan durante 1 minuto a 72 ° C. Para las siguientes rondas, hacer 10 segundos, 20 segundos y 10 segundos en cada temperatura correspondiente, con un paso de elongación final de 5 minutos a 72 ° C. Debido a que el número de ciclos necesarios para ampliar la piscina depende de la eficiencia de la recuperación de oligo, puede ser necesario para tratar de varios números de ciclo. Tenga cuidado de no sobre-amplificar la piscina, que está representado por un grupo de manchas en un gel de acrilamida. Muestras de amplificación de PCR se puede almacenar a 4 ° C hasta que se necesite.
10. El último paso en la preparación de oligo es transcribir el ARN utilizando el kit de MEGAshortscript ™ de Ambion. * El siguiente protocolo se ha adaptado de Ambion
    1. Descongele el tampón de reacción 10x T7, cuatro soluciones ribonucleótido y el agua a temperatura ambiente mientras se mantiene la mezcla de enzimas T7 en el hielo
    2. Montar la mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga de RNasa libre a temperatura ambiente. Los componentes del tampón de reacción puede causar la plantilla de ADN para precipitar si la reacción se mezcla en hielo.
    3. En el siguiente orden, pipeta 3 l agua libre de nucleasa, 2 l de tampón de reacción 10x, 2 l de cada solución 75 mM NTP, 5 l de ADN (la amplificación de PCR piscina oligo) y 2 l de enzima T7, para un volumen final de 20 l
    4. Flick el tubo suavemente para mezclar la reacción brevemente microcentrífuga para recoger la mezcla en el fondo del tubo.
    5. Incubar la reacción en un termociclador a 37 ° C durante 2 horas. El tiempo de incubación será la plantilla que dependen, por lo tanto, puede ser necesario el uso de un experimento de tiempo de curso para determinar el tiempo de incubación óptimo para el rendimiento máximo
    6. Después de 2 horas, retire la plantilla de ADN mediante la adición de 1 l de Turbo DNasa para la reacción y se incuba a 37 ° C durante 15 minutos adicionales
    7. Terminar la reacción y recuperar el ARN por extracción con fenol / cloroformo y precipitación con etanol.
       1. Para un volumen de reacción de 20 l, añadir 115 l de dH ₂ O y 15 l de acetato de sodio 3 M a la reacción.
       2. Mezclar bien a continuación, añadir 75 l de l ácido fenol y el 75 de cloroformo. Mezcle la solución por agitación, después de microcentrífuga durante un minuto a 13.000 rpm a temperatura ambiente. La transferencia de la capa acuosa a un tubo nuevo y repetir la extracción
       3. La transferencia de la capa acuosa a un tubo nuevo y añadir 150 ml de cloroformo. Vortex la mezcla y se centrifuga como antes. La transferencia de la capa acuosa a un tubo nuevo.
    8. Recuperar el ARN mediante la adición de dos volúmenes de etanol al 100% frío a la capa acuosa y mezclar bien. Enfriar la mezcla por un mínimo de 15 minutos a -20 ° C y centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a la máxima velocidad para precipitar el ARN. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspender el precipitado en 105 l de 0,1 x Tris-EDTA (TE) Buffer ..
11. Es difícil eliminar todos los nucleótidos libres a partir de la reacción kit T7, así que para obtener resultados más precisos, cuantificar el ARN utilizando RiboGreen.
    1. Para iniciar la cuantificación, en primer lugar lo suficientemente diluida TE 1x, 2.300 l + 50μL/sample.
    2. A continuación, hacer que el RiboGreen. Usted necesitará 1.000 l + 50 l / muestra. Para las muestras de gama alta (1 mg / ml a 20 ng / ml) de mezcla para el 1:200 RiboGreen en 1x TE, por las muestras de gama baja (50 ng / ml a 1 ng / ml) de mezcla para la 1:2000 RiboGreen en 1x TE ; Pipetear 50 L de solución RiboGreen en cada pocillo de una placa opaca, empezando por A1 y bajando, no a través de
    3. Diluir una solución de reserva de ARN a 2 mg / ml para las muestras de gama alta o de 100 ng / l para las muestras de gama baja
    4. Utilizando las soluciones de archivo, crear una curva estándar de seis posteriores diluciones 1:02 de la original de 2 mg / ml o 100 ng / mL de valores, con una pipeta 240 l de las acciones en un tubo de strip PCR. En los restantes siete tubos, pipetas 120 l de TE 1x. Tome 120 l de las acciones de ARN, y mezclarlos con el tubo 2. Tomar 120 l del tubo 2 y mezclar con el tubo 3. Repita hasta que el tubo 7. Tubo de 8, sólo tendrá TE y será su blanco. Añadir 50 l de las soluciones de la curva estándar en la placa opaca, A1: H2 (ejecutar la curva dos veces)
    5. En un nuevo tubo, mezclar 45 l de TE con 5 L de la piscina oligo y añadir todos l 50 a un pozo que contiene 50 L de RiboGreen.
    6. El uso de un lector de placas de configurar la máquina para leer la fluorescencia de la parte superior después de una combinación de un minuto con una longitud de onda de excitación de 485 nm y la longitud de onda de emisión de 530 nm y leer la placa de
    7. Use la curva estándar generada para cuantificar el ARN recuperado, lo que debe conservarse a -20 ° C.

Co-inmunoprecipitación de la piscina con un oligo RNP de interés

1. Antes de comenzar el co-inmunoprecipitación, preparar la Proteína A y Proteína G Dynabeads de Invitrogen mezclando en una proporción de 1:1, hasta un volumen final de 50 l por reacción. Por ejemplo, para dos reacciones que se añaden 50 l cada uno de cada cuenta.
2. Use un soporte de separación magnética como este de Novagen para mantener las cuentas en su lugar mientras se quita el sobrenadante y lavar las cuentas dos veces con un volumen igual de PBS frío 1x
3. Tras el segundo lavado, suspender las cuentas en un volumen igual de PBS frío y añadir 1 x 2 ng del anticuerpo por reacción. Esta cantidad puede variar en función de los anticuerpos, por lo que la experimentación es necesario encontrar las condiciones óptimas.
4. Incubar la mezcla de anticuerpos / cordón noche a 4 ° C sobre una plataforma giratoria
5. Por la mañana, añadir 2 g por reacción de ultrasonidos de ARN total de levadura para bloquear la unión no específica, y girar durante 30 minutos a 4 ° C.
6. Uso de la rejilla magnética para mantener las cuentas, separar el sobrenadante y lavar las cuentas dos veces con PBS frío 1x, dejando la PBS a partir de el segundo lavado en el tubo.
7. Saque los tubos nuevos, uno para cada reacción y alícuota de 50 ul de la mezcla de cuentas en cada tubo. Deje que las cuentas se siente mientras se prepara una mezcla maestra
8. Para cada reacción se añaden 200 ng de la piscina oligo, una relación equimolar de cartillas de protección, 2 g de levadura sonicado ARN total, 20 l de extracto nuclear HeLa (esta es la fuente RNP), y E de amortiguación para llevar el volumen hasta 120 l. Los cebadores de protección son las versiones de ARN de los cebadores universales. Plantillas de órdenes de la transcripción de los cebadores universales con una etiqueta de T7 se añade al final, luego transcribir el ARN de las plantillas con el MEGAshortscript Kit ™.
9. Eliminar el sobrenadante de las alícuotas de cuentas y abalorios resuspender en 120 l de la mezcla maestra. Roca de las reacciones a 4 ° C durante 1-2 horas.
10. Después de la incubación, para cada reacción, quite una pequeña alícuota (incluyendo las cuentas) durante un "total" muestra de ARN
11. Coloque el resto de las reacciones sobre la separación magnética de pie y eliminar el sobrenadante. Aunque no es necesario analizar este flujo a través de aguas abajo de la muestra, puede ser útil para guardar.
12. Lavar las perlas de 1.2 veces con 50 l de PBS frío 1x. El ARN unida al anticuerpo en los granos es el "IP" de la muestra.
13. Volver a suspender el "total" y las cuentas de "IP" en 50 l de SDS al 1% en buffer TE 0,1 x y el calor de las muestras a 65 ° C durante 15 minutos para eluir el RNA.
14. Eliminar el sobrenadante, que ahora contiene el ARN que antes era obligado a las cuentas y limpia por extracción con fenol / cloroformo seguida de una precipitación con etanol. Secar el pellet y resuspender en tampón 0,1 x 50 L TE.

La transcripción inversa y amplificación de co-IP en la preparación de muestras para el etiquetado de aminoallyl

1. A continuación, las muestras de ARN se transcriben de forma inversa y la amplificación de PCR. Para la reacción de transcripción inversa, el uso de los primers universales inversa.
2. Para cada muestra, comienza por la mezcla de 1 l deel primer invertir universal, con 1 l de la plantilla de ARN (a partir de la reacción de inmunoprecipitación) y 10 l de dH ₂ O. El calor de las reacciones a 70 ° C durante 5 minutos y luego se enfría en hielo o mantener a 4 ° C.
3. Mientras que las muestras frescas, hacer la mezcla maestra siguiente. Para cada reacción se combinan 4 l de 10 mM dNTPs, 2 l de buffer 10x Arrayscript, 1 l inhibidor de RNasa, y una enzima l transcripción inversa. Mezclar bien y añadir 8 l de la mezcla maestra a cada reacción de transcripción inversa.
4. Use una máquina de PCR para la incubación de las muestras a 42 º C durante 2 horas, seguido de 95 ° C durante 5 minutos, luego 4 ° C hasta que las muestras son necesarias para la amplificación.
5. Después de transcripción inversa del ARN de las muestras, las amplifican PCR utilizando los cebadores universales, con una de las cartillas que contienen una etiqueta T7. El número de ciclos necesarios para ampliar la piscina dependerá de la eficacia de la co-IP por lo que puede ser necesario probar varios ciclos. Cada reacción requiere de 5 l de buffer de reacción 10x Taq, 0,2 l de cada primer (100 mM), 1 l de la plantilla de cDNA (a partir de la reacción de transcripción inversa), 1 l de 10 mM dNTPs, 42,2 l de dH ₂ O, y 0,4 l de enzima Taq.
   
   Comenzar la PCR mediante la incubación de las muestras a 94 º C durante 3 minutos. A continuación, para cada ciclo, se desnaturalizan a 94 ° C durante 45 segundos, recocido a 55 ° C durante 30 segundos, y alargar a 72 ° C durante un minuto, con una elongación final a 72 ° C durante 10 minutos.
6. A continuación, transcribimos las muestras una vez más utilizando el Kit de MEGAshortscript ™, sin embargo, esta vez agregar 2 L de aminoallyl UTP, en lugar de la UTP T7. La UTP aminoallyl se utiliza para etiquetar el ARN con los tintes Cy.
7. Fenol / cloroformo y etanol precipitar las muestras. NO utilice Glycoblue o acetato de amonio, los cuales pueden interferir con la hibridación de las muestras a la matriz. Secar el pellet y resuspender en 4,5 l de 0,1 M de carbonato de sodio.

Amino-alil etiquetado de ARN con tintes Cy

1. Para comenzar el protocolo de etiquetado disolver cada uno de los tintes fluorescentes, Cy3 y Cy5, en 45 l de DMSO. Para evitar la luz, envolver los tubos en papel de aluminio y guardar a -20 ° C en la oscuridad
2. Añadir 2,5 l de agua libre de nucleasa de ARN de muestras y mezclar bien
3. A continuación, añada 3 l de Cy3 a la "total" de la muestra, y 3 l de Cy5 a la "propiedad intelectual" de la muestra. Incubar las muestras en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente, la muestra de Cy-3 a su vez, de color rojo o rosado, mientras que el Cy-5 se vuelve azul.
4. Para terminar la reacción, añadir 6 l de 4 M hidroxilamina-HCl a cada muestra, mezclar bien y girar brevemente. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
5. Purificar las muestras marcadas por extracción con fenol / cloroformo seguida de etanol precipitación y el pellet se resuspende en 50 l de 0,1 x TE

Hibridar muestras de los microarrays utilizando la matriz de Agilent Kit de hibridación

1. Comenzar la hibridación con cuidado mezcla de 50 l de tampón 10x bloqueo, 140 l de nucleasa libre de H2 _O, 25 l de la Cy3 marcado "total" la piscina, 25 l de la Cy5-etiquetados como "IP", piscina, 10 L de la buffer 25x fragmentación y 250 l de la hibridación de amortiguación 2x, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas. Microfuga la muestra brevemente para recoger la solución en la parte inferior del tubo y también para reducir las burbujas.
2. Coloque la tapa deslizante o-ring en la cámara de hibridación y con mucho cuidado la pipeta la solución en la diapositiva.
3. Coloque la matriz de detección en la parte superior de la tapa deslizante de "sandwich" de la solución. Recuerde que debe orientar la diapositiva matriz de modo que la etiqueta de Agilent en la matriz se enfrenta a la etiqueta de Agilent en la tapa deslizante.
4. Sujetar el sándwich de diapositivas / matriz en la cámara de hibridación y rotar a 50 º C durante 3 horas.
5. Mientras que la matriz es de rotación, que los siguientes 50 ml de soluciones en tubos cónicos de 50 ml: un cono lleno con 50 ml de dH ₂ O, dos soluciones tampón 1x SCC, cada uno en un tubo separado, y un buffer de 2 x SCC.
6. Después de la incubación de tres horas, con cuidado despinzar el sándwich de matriz / diapositiva y colocarla en el Erlenmeyer de 50 ml que contiene el tampón 2x ​​SCC. Con un par de pinzas, suavemente separar la matriz de la tapa deslizante y sacar la tapa deslizante. Tenga cuidado de no tocar la matriz como la diapositiva se saca. Cerca de la cónica y suavemente invierta durante 60 segundos.
7. Usando las pinzas, la transferencia de la matriz a la solución 1x SCC, tapar el tubo, y suavemente invierta durante 1 minuto después de transferencia de la matriz a la segunda solución 1x SCC y otra vez invierta suavemente durante un minuto.
8. Por último, la transferencia de la matriz al tubo de dH ₂ O y suavemente invierta durante 30 segundos.
9. Seca la matriz mediante la colocación de los bordes de la diapositiva en una Kimwipe. Continúe girando la matriz en la limpie y asegúrese de no interrumpir el lado que contiene los oligos.
10. Lugar en la matriz secaun vacío de 50 ml tubo cónico y escanear con un escáner de microarrays

La interpretación de los microarrays

1. El escáner de microarrays va a crear una imagen TIF de la matriz. Ejecutar esta imagen a través del software de extracción de características Agilent, utilizando el archivo de la red (suministrado por Agilent), que es único para cada grupo específico.
2. El software de Agilent se interpreta la señal en cada función para crear un archivo, que se analiza con un script en Perl. La señal en cada función es normalizar a la intensidad total en ese canal. Por ejemplo, en una función especial en el canal verde, la intensidad del canal verde de la característica individual se divide por el total de la intensidad del canal verde en todas las funciones. El resultado final es la relación de registro de la canal rojo a través del canal verde en cada función en la matriz.
3. La agrupación de los datos oligo de los microarrays se puede volver a asignar de nuevo en el genoma para obtener una imagen de dónde y con qué fuerza, con destino al RNP de interés.

Figura 1. Esquema experimental

A. Teja esquema. Después de seleccionar y descargar pre-mRNA secuencias de interés, el área de selección es de baldosas a través de 30 ventanas de nucleótidos que cambiar en incrementos de 10 nucleótidos. Flanco imprimación universal de los sitios de unión a cada lado de la ventana.

B. Matriz de síntesis. Azulejos órdenes oligo deben presentarse a Agilent, donde las secuencias se imprimirá en un microarray de oligonucleótidos personalizado.

C. Co-inmunoprecipitación. Después de hervir los oligos de la matriz, se incuban en el extracto de HeLa nuclear, a continuación, añadir el extracto de partículas magnéticas que se preparan con un anticuerpo contra el RNP de interés. Etiqueta de la piscina oligo comenzando con Cy3 y la piscina obligado IP con Cy5 y se aplican a la matriz de detección y escaneo.

Figura 2. La anotación del genoma con el análisis de datos y de enriquecimiento.

A. Convertir la puntuación media en cada coordenada genómico a partir de la matriz de datos de base diez registro y el mapa que la puntuación a las coordenadas dadas. Un ejemplo de este paso se da un promedio de tres superposición de 30 nt oligos con puntuaciones de 2, 4 y 0.5, donde se representa la puntuación media de enriquecimiento para cada uno de los 10 nt anterior. Las regiones genómicas seleccionadas se pueden visualizar mediante un especial de cadenas en el navegador del genoma USCS. La ventana del navegador es ejemplo dado en el gen CLTA, donde las características gen (exones / intrones / splicing alternativo, etc) se dan a lo largo de la parte inferior y las puntuaciones promedio diario de enriquecimiento de los oligos PTB con destino están representados por barras verticales oscuras de color rojo. PTB une fuertemente justo aguas arriba del exón 2 en el tracto polypyrimidine.

Discussion

Al realizar este procedimiento es importante recordar que la creación de la piscina es flexible y abierto a modificaciones, ya sea en el ARN o la proteína. A nivel del ARN orthologous regiones, las mutaciones de la enfermedad, los polimorfismos o mutaciones aleatorias pueden ser introducidos en la secuencia de oligonucleótidos. En el nivel de proteína del factor de unión a ARN pueden ser modificados por fosforilación u otras modificaciones post-traduccional. Además, el medio ambiente de unión puede ser manipulada para aumentar o disminuir los niveles de otros factores que interactúan y compiten con la proteína de unión a ARN de interés.