Summary
We beschrijven een proces voor fixatie, inbedden, snijden, en de beeldvorming van laat stadium
Abstract
De morfogenese van de
Protocol
- Vers voor te bereiden 2 ml van een fixatief oplossing met 12,5% Glutaraldehyde in 50 mM Cacodylate buffer (pH 7,4) in een 20 ml glazen scintillatieflesje. Voeg 8 ml n-heptaan en schud krachtig. Laat de twee fasen te scheiden. Verwijder de bovenste fase met n-heptaan verzadigd met glutaaraldehyde, plaats in een schone scintillatieflesje en zet apart. Dit zal het fixeermiddel oplossing.
- Verzamel 00-20 uur embryo's met behulp van een embryo's worden verzameld kamer, die is een klein mandje met een uitneembare Zeef. Verwijder de buitenste membraan door chorion weken embryo's in een 50% bleekwater-oplossing voor 2-3 minuten, of totdat de embryo's drijven naar het oppervlak van het bleekmiddel. Spoel grondig met ddH20 en dep embryo's op een papieren handdoek.
- Met behulp van een tang, pick-up Zeef, die bedekt is met dechorionated embryo's en plaatsen in het fixeermiddel oplossing, waardoor embryo's vallen van de mesh. Laat embryo's gedurende 1,5 uur vast te stellen op 4 ° C tijdens het mengen op een Nutator.
- Bereid een petrischaal bekleed met dubbelzijdig tape. Verwijder embryo's uit de fixeermiddel met behulp van een Pasteur pipet en plaats ze op tape oppervlak van Petri dish.Transfer de embryo's in een minimale hoeveelheid fixeermiddel oplossing voor de heptaan in het fixeermiddel te voorkomen dat het oplossen van de lijm van de tape. Schud de petrischaal op een enkele laag van de embryo's te maken. Plaats petrischaal in capuchon tot heptaan verdampt. Voeg genoeg PBS + 0,1% Tween20 om de embryo's te dekken. Hand-devitellinize laat stadium 16 embryo's onder een dissectie microscoop met een stompe naald wolfraam. Recover embryo's met een Pasteur pipet in een 1,5 ml microfugebuis. Stappen 5-7 worden uitgevoerd in deze microfugebuis.
- Spoel embryo's in 0,1 M Cacodylate buffer, pH 7,4 en vervolgens na de vast te stellen in een oplossing met 1% osmium tetroxide in 0,1 M Cacodylate Buffer, pH 7,4 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel embryo's met 0,1 M Cacodylate buffer, pH 7,4.
- Uitdrogen embryo's in een gegradeerde reeks van ethanol en aceton. Uitdrogen embryo's met 50% ethanol gedurende 10 minuten, gevolgd door 70% ethanol gedurende 10 minuten. Dan drogen in 90% aceton gedurende 10 minuten, en twee 100% aceton stappen van 10 minuten elk.
- Verwijder de aceton en vervolgens het infiltratie-proces door het toevoegen van een 1:1-EPON hars Spurr: aceton-mengsel aan de embryo's. Magnetron gedurende drie minuten met behulp van een Pelco Biowave Pro magnetron terwijl het monster onder vacuüm druk. Van toepassing zijn vacuüm druk om het monster voor een extra vijf minuten nadat de magnetron is beëindigd. Exchange de 1:1 hars, aceton-mengsel met 100% EPON-Spurr hars en magnetron weer onder vacuüm druk. Exchange de 100% Epon-Spurr hars een laatste keer, en een magnetron onder vacuüm druk.
- Met behulp van een Pasteur pipet, worden embryo's overgebracht van de microfugebuis om een siliconen inbedding mal. Lijn embryo's in een rij, zodat het achterste einde van het embryo lijn ligt met de taps toelopende rand van de mal. Bak in een 70 ° C oven gedurende de nacht.
- Verwijder de steekproef en voor te bereiden op snijden.
- Begin snijden 1 uM secties met behulp van een Diamond Histo Mes en Richert Ultracut E microtoom. Kennis te nemen van bij het eerste embryo sectie wordt bereikt. Vanaf dit punt, gesneden 100 urn in het monster. Verwijder een sectie met behulp van een lus, en plaats op een glasplaatje. Kort warmte van de sectie op een hete plaat. Vlekken op de sectie met behulp van een druppel methyleenblauw. Onder een lichtmicroscoop te identificeren het hart lumen.
- Snijd 90nm secties met behulp van een Diamond Ultra 45 ° Mes en Richert Ultracut E microtoom. Pick-up meerdere secties op een koperen rooster.
- Grids zijn gekleurd met 3% uranylacetaat verzadigd in 50% ethanol voor tien minuten en dan drie keer gespoeld met tweemaal gedestilleerd water. Vervolgens worden de roosters gekleurd met lood citraat (0.04gms opgelost in 10 ml dubbel gedestilleerd water en 100 ml 10M NaOH) gedurende 2,5 minuten in een kamer met NaOH pellets aan een CO 2-vrije omgeving te creëren. De roosters zijn driemaal gespoeld met tweemaal gedestilleerd water.
- Secties worden onderzocht met een JEOL 1200EX elektronenmicroscoop op 80Kv, en gefotografeerd met een AMT digitale camera.
Discussion
De morfogenese van de Drosophila embryonale hart buis heeft ontpopt als een waardevol modelsysteem voor het bestuderen van celadhesie en cel-vorm verandert tijdens de embryonale ontwikkeling. Een van de uitdagingen in het bestuderen van deze structuur is dat het lumen van het hart buis is moeilijk te visualiseren in hele berg embryo's. De techniek gedemonstreerd in deze video, die werd overgenomen van eerder beschreven procedures 1-2, heeft bewezen succesvol te zijn in efficiënt en betrouwbaar analyseren van een groot aantal van genotypen voor hart-buis-en lumen vorming van drie.
Acknowledgments
Ons werk op het hart buis formatie werd ondersteund door een National Science Foundation Grant (Award ID 0744165) om SGK
References
- Tepass, U., Hartenstein, V. The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. Drosophila Protocols. , (2000).
- Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation. J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).
