Summary
यह वीडियो लेख organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों और exogenously प्रेरित प्रभाव के विश्लेषण के लिए एक cytospin प्रक्रिया की स्थापना को दर्शाता है. Organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों की नकल
Abstract
पशु मॉडल और जीन विश्लेषण के लक्षित ablations दाखिला विशिष्ट रेटिना जीन समारोह के लिए शास्त्रीय रणनीति है. हालांकि, ट्रांसजेनिक, रेटिना विशेष या सशर्त पीटकर माउस मॉडल अक्सर जल्दी मारक प्रदर्शित करने या गंभीर विरूपताओं से ग्रस्त हैं, भ्रूण या जल्दी प्रसवोत्तर चरणों से परे एक विश्लेषण को रोकने.
प्राथमिक सेल संस्कृति exogenously लागू पुनः संयोजक कारक है, एक नियंत्रित वातावरण में या siRNA की मध्यस्थता जीन पछाड़ना जीन की overexpression के प्रभाव की जांच के लिए एक विकल्प है. Dissociated सेल संस्कृति लाभ है कि अंतर्जात लक्ष्य कोशिकाओं तक पहुँचने के संकेतों को कम कर रहे हैं, जिससे औषधीय हेरफेर के बाद exogenously ट्रिगर प्रभाव की पहचान की सुविधा. हालांकि, महत्वपूर्ण सेल सेल बातचीत शुरू enzymatic पाचन या यांत्रिक हदबंदी द्वारा नष्ट कर रहे हैं, भले ही फिर से एकत्रित retinospheroid 1 संस्कृतियों का इस्तेमाल कर रहे हैं.
इसके विपरीत करके, organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों neuronal बातचीत और कनेक्शन अभी भी संरक्षित 2-5 के साथ vivo स्थिति में एक शारीरिक के लिए करीब प्रणाली प्रदान करते हैं .
इस वीडियो लेख में हम (1) organotypic भ्रूण प्रसव के बाद, और वयस्क murine आँखों के विच्छेदन के peculiarities और (2) के विश्लेषण के लिए एक neuronal की हदबंदी और cytospin प्रक्रिया सहित रेटिना wholemount संस्कृतियों की तरह vivo में की स्थापना के कदम प्रदर्शन के द्वारा एक कदम प्रदान apoptosis और organotypic wholemounts में रेटिना सेल प्रसार, exogenously लागू रीकॉम्बीनैंट कारकों की उपस्थिति में संस्कृति के बाद उदा.
Protocol
सभी उपकरण और अभिकर्मकों बाँझ खरीदा जा या गर्मी या भाप निष्फल या 70% ETOH साथ निष्फल होने की जरूरत है.
लेखकों राज्य है कि जानवरों पर प्रयोगों में प्रदर्शन किया गया यूरोपीय परिषद निर्देशक 86/609/EEC () समुदाय के अनुसार देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रिया और संस्थागत पशु द्वारा निर्धारित नियमों के लिए पशुओं के उपयोग के बारे में NIH के दिशानिर्देश का पालन, देखभाल और विश्वविद्यालय ड्यूसबर्ग-Essen (जर्मनी) में समिति (IACUC) का उपयोग करें.
भाग 1: विभिन्न विकासात्मक चरणों के murine आँखों के Enucleation
भ्रूण आंखों की Enucleation
- समय गर्भवती matings ऊपर सेट कर रहे हैं और दिन की सुबह जिस पर एक योनि प्लग महिलाओं संभोग में पता चला है हमल दिन 0 नामित है.
- गर्भवती महिला गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान है जब भ्रूण के विकास के वांछित मंच (यहाँ: भ्रूण दिन (ई) 15) तक पहुँच गया है और एक 6 बोर्ड मोम पर तय है .
- पेट की दीवार ETOH 70% के साथ सिक्त है, midline साथ में कटौती करने के लिए और त्वचा flaps laterally 6 पिन के द्वारा तय कर रहे हैं.
- uterusses पेट, अलग और ठंड पीबीएस 6 के साथ एक बीकर को हस्तांतरित से हटा रहे हैं.
- भ्रूण अलग, एक पेट्री डिश और गर्भाशय की दीवार को हस्तांतरित कर रहे हैं और भ्रूण झिल्ली 6 संदंश के उपयोग के द्वारा ध्यान हटा रहे हैं.
- भ्रूण शिरच्छेद द्वारा मारे गए हैं.
- आँखे enucleated कर रहे हैं ठीक है, घुमावदार संदंश का उपयोग हो सकता है, थैली से आँखें "छीलने".
प्रसव के बाद और वयस्क आँखों के Enucleation
- युवा पिल्ले शिरच्छेद, पुराने ग्रीवा अव्यवस्था से पिल्ले और वयस्कों द्वारा मारे गए हैं.
- प्रसवोत्तर P15 मंच पर, समय बिंदु जब चूहों अपनी आँखें खुली, आंख slits के यंत्रवत् संदंश के उपयोग द्वारा खोला जा और वसंत कैंची के साथ आँख lids के दो अनुप्रस्थ कटौती से बढ़े हुए है.
- आंखें घुमावदार संदंश की मदद से enucleated हैं, कक्षा के लिए दबाव लागू करने.
नोट: प्रसव के बाद दो दिन में, कक्षीय हड्डियों अभी भी उपास्थि हैं, यह महत्वपूर्ण है के लिए बहुत अधिक दबाव लागू नहीं है, जबकि आँखों को दूर करने की कोशिश कर रहा है.
इसके विपरीत करके, वयस्क चूहों में, कक्षीय हड्डियों फर्म हैं. इस प्रकार, क्रम में आंखों पता लगाना के लिए यह अग्रिम में आंख slits के विस्तार के बिना कक्षा के लिए दबाव लागू करने के लिए पर्याप्त है.
भाग 2: भ्रूण प्रसव के बाद, और वयस्क murine retinas के विच्छेदन
Retinas के विच्छेदन
- आँखें बाँझ पीबीएस और आसपास आँख परतों एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत हटा रहे हैं के साथ एक छोटे से पेट्री डिश में रखा जाता है.
- बाहरी आँख परतों प्रसवोत्तर चरणों और ऑप्टिक तंत्रिका के लिए रवाना वसंत कैंची या pinched बंद की मदद से काट संदंश द्वारा के रूप में संभव के रूप में आधार के करीब हो गया है वयस्क आँखों में, निकालें.
- आँख बारी, ताकि जहां ऑप्टिक तंत्रिका मूल रहते छेद के साथ पीछे की ओर का सामना करना पड़ रहा है. और साइट जहां ऑप्टिक तंत्रिका आँख परतों penetrated से दो बहुत ठीक संदंश के सुझावों के साथ रेटिना वर्णक उपकला के बीच subretinal अंतरिक्ष दर्ज करें.
नोट: आमतौर पर, वर्णक उपकला आसानी से अपने काले रंग से पहचान किया जा सकता है. विशेष रूप से विवर्ण पशुओं में - कुछ उत्परिवर्ती माउस उपभेदों में इस वर्णक परत लेकिन हो सकता है, कर सकते हैं और नहीं रंग इस तरह आसानी से नहीं हो पता लगाने के लिए हो सकता है. - संलग्न रंजित झिल्ली और श्वेतपटल के साथ ध्यान से दोनों संदंश के साथ दोनों ओर से फाड़ वर्णक उपकला निकालें.
- कॉर्निया के स्तर को ऊपर परतों छीलकर, तो लेंस की ओर आंख कप बारी और कॉर्निया वर्णक उपकला, रंजित झिल्ली और श्वेतपटल के साथ मिलकर हटायें, जबकि अन्य संदंश द्वारा शेष रेटिनल कप पकड़े.
- कांच का एक साथ और छोटे लेंस के साथ मुट्ठी जबकि संदंश के साथ फाड़, जगह में दूसरा संदंश के साथ रेटिना wholemount रखने.
नोट: जब भ्रूण आंखों विदारक, कांच के साथ कांच शरीर के नीचे के लिए पूरी तरह से त्रिकोणीय, केशिका तम्बू की तरह जाल के साथ हटायें सुनिश्चित करें.
वयस्क आँख में, कांच के पक्ष में समझा जाना चाहिए और देखभाल संदंश के सुझावों के साथ अपनी सामग्री चिपचिपा और संदंश करने के लिए लाठी है, अपनी हटाने निरोधक के रूप में नहीं पियर्स शीशे लिया जा. - Organotypic wholemount संस्कृति के लिए रेटिना कप एक 96 अच्छी तरह से 200 μl Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (नीचे देखें) से युक्त थाली में एकत्र कर रहे हैं.
नोट: व्यक्तिगत retinas के विच्छेदन के बीच रखने के लिए, संग्रह 96 अच्छी तरह से मध्यम संस्कृति के pH के रूप में इनक्यूबेटर में संस्कृति के माध्यम युक्त थाली सीओ 2 कार्बोनेट प्रणाली के माध्यम से शुरू हो रहा है.
भाग 3: murine organotypic रेटिना wholemountसंस्कृति
- भार 7.8g Dulbecco संशोधित बाज मध्यम / पोषक तत्व मिश्रण F-12 हैम (DMEM) और 0.6g 3 NAHCO और MiIliQ पानी में दोनों भंग के द्वारा 500 मिलीलीटर संस्कृति तैयार . 7.15 पीएच को समायोजित करें. हुड के नीचे, और 2.5 मिलीलीटर gentamicine (200 मिमी), 50μl सोडियम selenite (स्टॉक:: 52μg/ml), प्रोजेस्टेरोन (60μg/ml शेयर): APO-transferin 50mg, 50μl putrescin (60mg/ml शेयर) जोड़ें. मिश्रण और एक बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से फिल्टर. तुरंत पहले उपयोग मिलीलीटर मध्यम संस्कृति के प्रति 10μl glutamine (200 मिमी) जोड़ें.
नोट: इस सीरम और इंसुलिन से मुक्त मध्यम 4 ° C पर भंडारित किया जा सकता है 2 सप्ताह के लिए और apoptosis शामिल प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में कोई इंसुलिन प्रभाव counteracts. यदि अब के लिए wholemounts की तुलना में 24 घंटों ऊष्मायन वांछित है और कोशिका मृत्यु दर का मूल्यांकन नहीं किया जाएगा, इंसुलिन सीरम (जैसे भ्रूण बछड़ा सीरम, एफसीएस) या पूरक के लिए जीवित रहने की दरों में सुधार करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए. - संस्कृति शुरू करने से पहले, रेटिना wholemounts 37 पर 15 मिनट के लिए पूर्व incubated ° सी के साथ 200 μl गर्म, पीएच संतुलित 0.5mg/ml hyaluronidase युक्त एम ller glia के भीतरी और बाहरी सीमित झिल्ली युक्त hyaluronidase पूर्व पचाने में DMEM कोशिकाओं, exogenously लागू पदार्थों के प्रवेश की सुविधा.
- Retinas के रूप 2ml रासायनिक परिभाषित Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम में के रूप में संभव है और organotypic wholemounts के रूप में सुसंस्कृत कुछ hyaluronidase साथ 24 अच्छी तरह से एक थाली में स्थानांतरित कर रहे हैं.
नोट: retinas स्थानांतरित करने के लिए, एक 1ml पिपेट का उपयोग करें और विंदुक टिप कुछ मिलीमीटर कटौती करने के लिए खोलने को चौड़ा. भ्रूण आंखों के लिए, एक 200 μl विंदुक टिप के लिए पर्याप्त है. काटने किनारों और एक दूसरे विंदुक टिप के सम्मिलन घुमा द्वारा smoothened होना चाहिए.
24-48 बजे अल्पकालिक संस्कृतियों के लिए, सभी चरणों को बेंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन अगर संस्कृतियों के संक्रमण निकला एक समस्या हो, एक हुड के तहत काम करना चाहिए. - 48 घंटे 37 ° C एक 5% सीओ 2 माहौल में जैसे और पुनः संयोजक कारकों के साथ औषधीय उपचार के अधीन - संस्कृतियों 24 के लिए रखा जाता है .
भाग 4: सुसंस्कृत रेटिना wholemounts की हदबंदी
- वांछित संस्कृति समय के बाद, retinas 2ml दौर नीचे Eppendorf ट्यूबों के साथ 850 μl पीबीएस और 50 μl गोजातीय सीरम albumine (BSA, 30 मिलीग्राम / एमएल) युक्त में एकत्र कर रहे हैं.
- Retinas के साथ एक हीटिंग ब्लॉक, 37 में गर्म डिग्री सेल्सियस में Eppendorf ट्यूबों प्लेस
- प्रत्येक Eppendorf ट्यूब के लिए 25 μl collagenase (200 यू / एमएल) और 25 μl hyaluronidase (20mg/ml) जोड़ें और एकल कक्ष निलंबन में 3 siliconized पाश्चर विंदुक के माध्यम से गुजरता द्वारा अलग retinas शुरू.
- 10 μl trypsin (1mg/ml) जोड़ें, 3-5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर धीरे धीरे 3-5 बार विंदुक ऊपर और नीचे siliconized पाश्चर विंदुक के साथ ऊतक यंत्रवत् अलग कर देना.
- 10 μl DNase मैं (5mg/ml) जोड़ें, फिर 3-5 मिनट के लिए है, तो धीरे धीरे 3-5 बार विंदुक ऊपर और siliconized पाश्चर विंदुक के साथ नीचे इंतजार.
नोट: enzymatic पृथक्करण के लिए ऊष्मायन समय बदलता है और निर्भर करता है आँखें और विकास मंच के आकार पर, क्रमशः. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ऊतक के enzymatic पाचन के मंच की जाँच करें. - यदि अब तक सेल निलंबन समरूप नहीं है, लेकिन अभी भी प्रमुख सेल समुच्चय होता है, तो अतिरिक्त 10 μl trypsin और 10 μl DNase मैं जोड़ने
- जब सेल निलंबन सजातीय है, ऊतक के पाचन के अलावा 10 μl EDTA (0.5 एम) से बंद कर दिया है, Eppendorf ट्यूब हीटर और सेल निलंबन से हटा रहे हैं 1 के लिए 1ml, ताजा बर्फ के ठंडे 8% paraformaldehyde के अलावा द्वारा तय कर रहे हैं (पीएफए) के एक रोटेशन हिलनेवाला पर कमरे के तापमान पर.
भाग 5: अलग सेल निलंबन की धुलाई
- सेल निलंबन 4 में 5 मिनट के लिए एक ठंडा अपकेंद्रित्र में डिग्री सेल्सियस और 0.2 आरसीएफ centrifuged है.
- सतह पर तैरनेवाला त्याग और गोली 1ml पीबीएस युक्त 3mg/ml BSA में फिर से निलंबित कर दिया है.
- इन धोने कदम दो बार दोहरा करने के बाद, गोली अंततः 500 μl पीबीएस युक्त 3mg/ml BSA, 5mm EDTA और 0.1% सोडियम azide में फिर से निलंबित कर दिया.
नोट: सोडियम एसिड के अलावा 4 में कई दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए सेल निलंबन के भंडारण की अनुमति हालांकि, अगर एक immunocytochemical धुंधला पालन करेंगे, सोडियम एसिड resuspension बफर नहीं जोड़ कर धुंधला गुणवत्ता के नुकसान में यह परिणाम के रूप में.
भाग 6: मात्रात्मक apoptosis और प्रसार के विश्लेषण के लिए सेल निलंबन के Cytospin
- एक खुर्दबीन पाले सेओढ़ लिया के अंत में, एक या दो छेद और एक cytospin कीप के साथ स्लाइड cytospin फिल्टर एक cytospin स्लाइड क्लिप में डाला जाता है. स्लाइड क्लिप और बंद cytospin रोटर में तैनात है.
- अलग सेल निलंबन धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा homogenized है.
नोट: रेटिना के विकास के चरण पर निर्भर करता है, पृथक्करण प्रक्रिया से सेल निलंबन की आवश्यकता हो सकती हैपीबीएस के साथ पतला करने के लिए कक्षों की एक गणनीय संख्या प्राप्त है. - सेल निलंबन का एक विभाज्य (100 μl) cytospin कीप के लिए लागू किया जाता है.
नोट: जब कीप के लिए सेल निलंबन pipetting, पिपेट की नोक चिमनी के नीचे करने के लिए सभी तरह से नीचे तक पहुंच जाना चाहिए. यह महत्वपूर्ण है विंदुक के दूसरे दबाव बिंदु के माध्यम से धक्का नहीं के रूप में इस हवाई बुलबुले, जो सेल स्थान में दिखाई cytospin के बाद हो जाएगा बनाता है और कोशिकाओं की गिनती बाधित है. - सेल निलंबन 7 मिनट के लिए 700 rpm पर एक स्लाइड पर देखा है.
- Exogenously लागू कारकों के प्रभाव के apoptosis स्तर पर निर्धारण के लिए 4 के साथ कोशिकाओं दाग जा सकता है '(DAPI; 2μg/ml) ,6-Diamidino-2 - phenylindole, फ्लोरोसेंट बढ़ते मध्यम के साथ मुहिम शुरू की. सेल apoptosis में परिवर्तन cytospin सेल स्पॉट में कम से कम 1000 कोशिकाओं (कम से कम 10 pycnotic नाभिक शामिल) की गिनती और कोशिका मृत्यु दर कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में में गणना की है 3,4 मायने रखता है के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
नोट: वैकल्पिक रूप से, apoptotic नाभिक के वितरण TDT मध्यस्थता dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL के) द्वारा 3 flatmounts या सुसंस्कृत रेटिना wholemounts के sections4 cryostat में मूल्यांकन किया जा सकता है. - सेल प्रसार का पता लगाने के लिए, BrDU (5 सुक्ष्ममापी) जोड़ा जा संस्कृति और BrdU निगमन के अंत से पहले 6 immunocytochemical एक विरोधी BrDU एंटीबॉडी (जैसे विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, आयोवा, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग धुंधला द्वारा सेल homogenates के cytospins में कल्पना कर सकते हैं.
- अलग रेटिना सेल प्रकार पर उपचार के प्रभाव cytospins में कल्पना न्यूरॉन (नाड़ीग्रन्थि सेल मार्कर) Brn3a या opsin (फोटोरिसेप्टर मार्कर) और DAPI साथ counterstaining जैसे विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा किया जा सकता है.
भाग 7: प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1: murine organotypic रेटिना wholemounts की तैयारी में कदम
दोनों आँखों से माउस की एक प्रमुख बी लेंस पक्ष के साथ murine आंख ऊपर, अभी भी जगह में सभी परतों. सी ऑप्टिक तंत्रिका के साथ पीठ से murine आँख अभी भी जुड़ी हुई है. डी श्वेतपटल और वर्णक उपकला आंशिक रूप से हटाया के साथ murine आँख. ई के साथ murine रेटिना कॉर्निया श्वेतपटल, और वर्णक उपकला पूरी तरह से हटा दिया, लेकिन लेंस और अभी भी जगह में कांच का. एफ murine लेंस और शीशे के साथ रेटिना wholemount कप हटा. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
चित्रा 2: organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों के cytospin और वर्गों द्वारा विश्लेषण
Apoptosis के विश्लेषण के लिए अलग सेल निलंबन के cytospins DAPI द्वारा दाग रहे हैं और pycnotic नाभिक परमाणु विखंडन या chromatin संक्षेपण द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है (एक में arrowheads) . वैकल्पिक रूप से, wholemount (CE, murine रेटिना प्रसव के बाद के दिन (पी) 2) वर्गों या रेटिना flatmount (एफ) TUNEL के परख करने के लिए अधीन किया जा सकता है और DAPI (ई) के साथ counterstained. अलग रेटिना सेल प्रकार पर उपचार के प्रभाव cytospins में न्यूरॉन नाड़ीग्रन्थि सेल मार्कर Brn3a (बी में तीर) की तरह विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा visualized किया जा सकता है GCL, नाड़ीग्रन्थि सेल परत, लीग, संभावित भीतर परमाणु परत . कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.
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Discussion
पृथक्करण, monolayer अधिक murine organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों 2-5, retinospheroid या फिर से एकत्रित 3D उपगोल संस्कृतियों 1 neuronal बातचीत और कनेक्शन के संरक्षण में निहित है, का लाभ vivo स्थिति में नकल उतार. पूर्व 2 रिपोर्ट की तुलना में, हमारे वीडियो लेख murine आँखें और रेटिना को नुकसान पहुँचाए बिना लेंस और कांच शरीर के हटाने सहित विभिन्न विकास के चरणों की retinas के विच्छेदन के enucleation में peculiarities के एक विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करता है. लेंस और शीशे को हटाने के औषधीय जोड़तोड़ के लिए जरूरी है दोनों के रूप में रेटिना परतों पदार्थों के उपयोग में बाधा है. अन्य रिपोर्ट murine explant संस्कृति प्रणालियों के विपरीत, हम सहायक सामग्री, जैसे polycarbonate 2 झिल्ली, हमारी organotypic संस्कृति के लिए उपयोग नहीं करते हैं, लेकिन संस्कृति रेटिना wholemount कप मुक्त फ्लोटिंग, अतिरिक्त exogenously लागू 3-5 पदार्थों के लिए पहुंच की सुविधा है.
इंसुलिन के बिना रासायनिक परिभाषित, सीरम और पूरक मुक्त संस्कृति के माध्यम का उपयोग केवल कम समय संस्कृति के लिए अनुमति देता है (24 - 48 घंटे), लेकिन apoptosis के 3 स्तरों या FCS और खुराक की वृद्धि कारक नकल उतार प्रभाव पर इंसुलिन के प्रभाव counterbalancing परहेज कर रहे हैं.
अधिकांश apoptosis और proliferations अध्ययन प्रभावों की मात्रा का ठहराव के लिए MTT assays या FACS विश्लेषण का उपयोग करें. तथापि, हम मात्रात्मक apoptosis और प्रसार के लिए कदम प्रदर्शन हदबंदी के सुसंस्कृत retinas के द्वारा एक कदम प्रदान cytospin द्वारा विश्लेषण. जहाँ तक हमारे अनुभव के रूप में चला जाता है, DAPI या BrDU दाग सेल स्पॉट में नाभिक के मैनुअल गिनती हालांकि थकाऊ है और समय लेने - murine retinas में विशेष रूप से, रेटिना apoptosis और प्रसार को बढ़ाता के लिए सबसे सही तरीका है.
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Acknowledgments
लेखकों organotypic संस्कृतियों और तकनीकी सहायता के लिए अमेरिकी Laub और अमेरिकी Gerster की स्थापना के साथ मदद के लिए प्रारंभिक ई. डे ला रोजा और एअर इंडिया Valenciano धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBS | Reagent | Sigma-Aldrich | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma-Aldrich | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma-Aldrich | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma-Aldrich | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma-Aldrich | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma-Aldrich | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Carl Roth Gmbh | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma-Aldrich | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma-Aldrich | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma-Aldrich | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche Group | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma-Aldrich | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | SERVA Electrophoresis | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma-Aldrich | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma-Aldrich | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | Falcon BD | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | Falcon BD | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand GmbH | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
References
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
