Summary
Este artículo video demuestra el establecimiento de cultivos de retina organotípicos wholemount y un procedimiento citospina para el análisis de los efectos inducidos exógenamente. Organotípicos culturas wholemount imitar la retina
Abstract
Ablaciones específica de genes y el análisis de modelos animales es la estrategia clásica para inscribir a la función de genes específicos de retina. Sin embargo, transgénicos, modelos knockout específicos retina-o condicional del ratón a menudo muestran letalidad temprana o sufren de malformaciones severas, impidiendo un análisis más allá de las etapas embrionarias o postnatal temprano.
Cultivo de células primarias es una alternativa para investigar los efectos de la aplicación exógena de factores recombinantes, la sobreexpresión de los genes o siRNA mediada por caída de genes en un ambiente controlado. Cultivo de células disociadas tiene la ventaja de que las señales endógenas alcanzar las células diana se reducen, lo que facilita la identificación de forma exógena efectos activados después de la manipulación farmacológica. Sin embargo, importantes interacciones célula-célula son inicialmente destruidas por digestión enzimática o la disociación mecánica, aunque reagrupadas culturas retinospheroid 1 se utilizan.
Por el contrario, las culturas organotípicos wholemount retina proporcionar un sistema de cerca las necesidades fisiológicas en la situación in vivo de interacciones neuronales y las conexiones de 5.2 aún se conservan.
En este artículo ofrecemos un vídeo paso a paso la demostración de (1) el establecimiento de in-vivo como organotípicos culturas retina wholemount incluyendo las peculiaridades de los ojos de la disección de embriones murinos, postnatal y adulto, y (2) un procedimiento de disociación y citospina para el análisis de las neuronas la apoptosis y la proliferación de las células de la retina en wholemounts organotípicos, por ejemplo, después de la cultura en la presencia de factores exógenos aplicados recombinante.
Protocol
Todos los equipos y reactivos para comprar estéril o tiene que ser calor o vapor esterilizado o esterilizado con EtOH al 70%.
Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Duisburg-Essen (Alemania).
Parte 1: La enucleación de ojos murino de diferentes etapas de desarrollo
Enucleación de ojos embrionarias
- Apareamientos vez embarazadas se establecen y la mañana del día en que se detecta un tapón vaginal en el apareamiento las hembras se designa 0 días de gestación.
- La mujer embarazada se sacrificaron por dislocación cervical cuando el desarrollo de los embriones se ha llegado a la etapa deseada (en este caso: el día embrionario (E) 15) y se fija en una tabla de cera 6.
- La pared abdominal se humedece con EtOH al 70%, corte a lo largo de la línea media y los colgajos de piel se fijan lateralmente por los pines 6.
- El uterusses se retiran del abdomen, individual y se transfiere a un recipiente con PBS frío 6.
- Los embriones se separan, se transfirió a una placa de Petri y la pared del útero y las membranas embrionarias son retiradas por el uso de fórceps 6.
- Los embriones son sacrificados por decapitación.
- Los ojos son enucleados ser el uso de unas pinzas finas, curvas, "peeling" de los ojos de la cuenca del ojo.
Enucleación de ojos postnatal y adulto
- Los cachorros son muertos por decapitación, cachorros y adultos mayores por dislocación cervical.
- Hasta la etapa postnatal P15, el punto de tiempo en que los ratones que abras sus ojos, aberturas del ojo tiene que ser mecánicamente abierta por el uso de fórceps y ampliada por dos cortes transversales de los párpados con una tijera de primavera.
- Los ojos son enucleados con la ayuda de pinzas curvas, aplicando presión a la órbita.
Nota: Como en el día postnatal 2, los huesos orbitales son aún cartilaginosos, es importante no aplicar demasiada presión al intentar quitar los ojos.
Por el contrario, en los ratones adultos, los huesos orbitales son firmes. Por lo tanto, con el fin de la enucleación de los ojos es suficiente para aplicar presión en la órbita sin ampliar las ranuras del ojo por adelantado.
Parte 2: La disección de embriones murinos retinas, postnatal y adulto
La disección de la retina
- Los ojos se colocan en una pequeña placa de Petri con PBS estéril y las capas del ojo lo rodea se retiran bajo un microscopio de disección.
- Para eliminar las capas externas del ojo, en las etapas post-natal y los ojos de adultos en el nervio óptico tiene que ser cortado por la ayuda de unas tijeras de primavera o fuera aplastado por unas pinzas tan cerca de la base como sea posible.
- A su vez a los ojos, para que la parte de atrás con el orificio por donde el nervio óptico originalmente residía hacia usted. Entrar en el espacio subretinal entre la retina y el epitelio pigmentario con las puntas de dos pinzas muy bien desde el lugar donde el nervio óptico penetrado en las capas del ojo.
Nota: Normalmente, el epitelio pigmentario pueden ser fácilmente identificados por su color oscuro. En algunas cepas de ratones mutantes - especialmente en los animales albinos - esta capa de pigmento sin embargo, puede no ser de color y por lo tanto no puede ser fácilmente de detectar. - Eliminar el epitelio pigmentario de la membrana coroides y la esclerótica conectado con cuidado desgarro a ambos lados con las dos pinzas.
- Pelar las capas hasta el nivel de la córnea, luego gire el ocular hacia el objetivo y eliminar la córnea, junto con el epitelio pigmentario, membrana coroides y la esclerótica, mientras que la celebración de la copa de retina restante por las pinzas de otros.
- Captar el humor vítreo junto con el pequeño lente y un desgarro, mientras que con una pinza, mantenga el wholemount la retina en su lugar con las pinzas de segundo.
Nota: Cuando la disección de los ojos embrionarias, asegúrese de eliminar por completo el triangular, tienda-como plexo capilar por debajo del cuerpo vítreo junto con el humor vítreo.
En el ojo del adulto, el vítreo se ha de descubrir a los lados y el cuidado tiene que tener cuidado de no perforar el vítreo con la punta de la pinza que su contenido es viscoso y se adhiere a la pinza, lo que dificulta su eliminación. - Para la cultura wholemount organotípicos las copas de retina se recogen en una placa de 96 pocillos con 200 l de Dulbecco modificado medio de Eagle (ver más abajo).
Nota: Entre la disección de las retinas individuales, mantener la placa de recolección de 96 pozos que contienen el medio de cultivo en la incubadora como el pH del medio de cultivo es provocado por el CO 2 a través del sistema de carbonato.
Parte 3: murino wholemount retina organotípicoscultura
- Preparar 500 ml de la cultura por medio modificado de ponderación de 7,8 g de Dulbecco Eagle / mezcla de nutrientes F-12 HAM (DMEM) y 0,6 g de NaHCO3 y la disolución de ambos en el agua MiIliQ. Ajustar el pH a 7,15. Añadir 50 mg apo-transferrina, 50μl putrescina (stock: 60mg/ml), 50μl selenito de sodio (stock: 52μg/ml), progesterona (stock: 60μg/ml), y 2,5 ml de gentamicina (200 mM) bajo el capó. Mezclar y filtrar a través de un filtro de tapa de la botella. Inmediatamente antes de añadir el uso de glutamina 10μl (200 mm) por medio de cultivo ml.
Nota: Este medio sin suero y sin la insulina se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de dos semanas y se utiliza para experimentos de inducción de apoptosis como no contrarresta los efectos de la insulina. Si la incubación de wholemounts por más de 24 horas que se desea y las tasas de muerte celular no se evaluarán, de insulina en suero (por ejemplo, suero fetal bovino, FCS) o suplementos deben ser añadidos para mejorar las tasas de supervivencia. - Antes de iniciar la cultura, la wholemounts retina se pre-incubaron durante 15 min a 37 ° C con 200 ul caliente, con pH balanceado DMEM conteniendo hialuronidasa 0.5mg/ml para pre-digerir la hialuronidasa que contiene la membrana limitante interna y externa de las células de Müller M las células, facilitando la penetración de las sustancias aplicadas exógenamente.
- Retinas se transfieren a una placa de 24, así como con el menor número posible de hialuronidasa y culta como wholemounts organotípicos en 2 ml de constitución química definida medio de Dulbecco modificado del águila.
Nota: Para la transferencia de las retinas, el uso de una pipeta de 1 ml y cortar la punta de la pipeta a unos pocos milímetros para ensanchar la abertura. Para los ojos de embriones, una punta de pipeta de 200 l es suficiente. Los filos de corte se pulirán con la inserción y la torsión de un segundo punta de la pipeta.
Por 24-48 horas a corto plazo las culturas, todas las medidas se pueden realizar en el banco, pero si la contaminación de las culturas resulta ser un problema, se debe trabajar bajo el capó. - Culturas se mantienen durante 24 a 48 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera y por ejemplo, sometidos a tratamiento farmacológico con factores recombinantes.
Parte 4: La disociación de la culta wholemounts retina
- Después del tiempo de la cultura deseada, la retina se recogen en tubos Eppendorf de 2 ml con fondo redondo, que contiene 850 l de PBS y 50 l de albúmina sérica bovina (BSA, 30 mg / ml).
- Colocar tubos Eppendorf con retinas en un bloque de calefacción, calienta a 37 ° C.
- Añadir 25 l de colagenasa (200 U / ml) y 25 l hialuronidasa (20mg/ml) a cada tubo Eppendorf y empezar a disociar la retina en suspensión de células individuales en un 3 pasa a través de una pipeta Pasteur siliconada.
- Añadir 10 l de tripsina (1mg/ml), espere 3-5 minutos, y luego, lentamente, una pipeta 3-5 veces arriba y abajo con silicona pipeta Pasteur para disociar mecánicamente el tejido.
- Añadir 10 l de DNasa I (5mg/ml), de nuevo esperar 3-5 minutos, luego, lentamente, una pipeta 3-5 veces arriba y abajo con silicona pipeta Pasteur.
Nota: El tiempo de incubación para la disociación enzimática es variable y depende del tamaño de los ojos y la etapa de desarrollo, respectivamente. Compruebe la etapa de la digestión enzimática del tejido con cuidado pipeteando arriba y abajo. - Si la suspensión celular no es homogénea, por ahora, pero todavía contiene grandes agregados de células, añadir otros 10 l de tripsina y 10 l DNasa I.
- Cuando la suspensión celular es homogénea, la digestión de los tejidos se detiene mediante la adición de 10 l de EDTA (0,5 M), los tubos Eppendorf se retiran de la estufa y las suspensiones de células se fijan para 1h de la adición de 1 ml fresca, bien fría paraformaldehído 8% (PFA) a temperatura ambiente en un agitador de rotación.
Parte 5: Lavado de suspensiones de células disociadas
- La suspensión celular se centrifugó durante 5 min a 4 ° C y en el 0,2 fcr en una centrífuga de refrigeración.
- Se desecha el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 1 ml de PBS que contenía BSA 3mg/ml.
- Después de repetir los pasos de lavado dos veces, la pastilla es finalmente resuspendidas en 500 l de PBS que contiene 3mg/ml BSA, 5 mM EDTA y 0,1% de azida de sodio.
Nota: La adición de ácido de sodio permiten el almacenamiento de la suspensión celular durante varios días a 4 ° C. Sin embargo, si una tinción inmunocitoquímica va a seguir, no añada ácido de sodio para el buffer de resuspensión, ya que esto resulta en la pérdida de la calidad de la tinción.
Parte 6: Cytospin de suspensiones de células de la apoptosis y el análisis cuantitativos proliferación
- Un portaobjetos esmerilado final, un filtro citospina con uno o dos agujeros y un embudo citospina se insertan en una imagen en la diapositiva cytospin. El clip de presentación se cierra y se coloca en el rotor cytospin.
- La suspensión de células disociadas se homogeniza suavemente pipeteando arriba y abajo.
Nota: Dependiendo de la etapa de desarrollo de la retina, la suspensión de células a partir de el procedimiento de disociación que tenga quediluirse con PBS para obtener un número contable de las células. - Una alícuota (100 l) de la suspensión celular se aplica a un embudo de cytospin.
Nota: Al pipetear la suspensión de células en el embudo, la punta de la pipeta debe recorrer todo el camino hasta la parte inferior del embudo. Es importante no empujar a través del segundo punto de resistencia de la pipeta ya que esto crea burbujas de aire, que será visible en el lugar de células después de la citocentrifugación y dificulta el recuento de células. - La suspensión celular se detecta en una diapositiva a 700 rpm durante 7 minutos.
- Para la determinación del efecto de factores exógenos aplicados en los niveles de apoptosis de las células se pueden teñir con 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 2μg/ml), montado con fluorescentes medio de montaje. Los cambios en la apoptosis de las células puede ser determinado por el recuento mínimo de 1000 células (que comprende al menos 10 núcleos picnóticos) en los lugares de células citospina y la tasa de muerte celular se calcula como porcentaje de las células de la cuenta total de 3,4.
Nota: Como alternativa, la distribución de los núcleos apoptóticos pueden ser evaluados en flatmounts 3 o criostato sections4 de cultivo wholemounts la retina por TDT mediada por dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL). - Para la detección de la proliferación celular, BrdU (5 M) se pueden añadir 6 horas antes del fin de la cultura y la incorporación de BrdU visualizado en cytospins de los homogeneizados de células por tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-BrdU (por ejemplo, hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, Iowa, EE.UU.).
- El efecto del tratamiento sobre los diferentes tipos de células de la retina pueden ser visualizados en cytospins por los anticuerpos específicos de neuronas como Brn3a (marcador de las células ganglionares) o opsina (fotorreceptores marcador) y contratinción con DAPI.
Parte 7: Resultados de Representante
Figura 1: Pasos en la preparación de la retina murina wholemounts organotípicos
A la cabeza de ratón con los dos ojos. B murino ojo con lente de lado, todas las capas siguen en su lugar. Murino ojo C de la parte posterior con el nervio óptico todavía unido. Ojos D murino con esclera y el epitelio pigmentario parcialmente removido. E retina murino con epitelio de la córnea, esclera y el pigmento eliminado por completo, pero la lente y vítreo sigue en pie. eliminado F murino taza de la retina wholemount con la lente y el vítreo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.
Figura 2: Análisis de las culturas organotípicos wholemount la retina por citocentrifugación y secciones
Para el análisis de la apoptosis, cytospins de suspensiones de células disociadas se tiñen por DAPI y núcleos picnóticos se pueden distinguir por la fragmentación nuclear o condensación de la cromatina (puntas de flecha en A). Por otra parte, las secciones wholemount (CE, día retina murina postnatal (P) 2) o flatmount retina (F) puede ser sometido a un ensayo de TUNEL y de contraste con DAPI (E). El efecto del tratamiento sobre los diferentes tipos de células de la retina pueden ser visualizados en cytospins por los anticuerpos específicos de neuronas como las células ganglionares marcador Brn3a (flechas en B) GCL, capa de células ganglionares;. INL, prospectivo capa nuclear interna. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.
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Discussion
La ventaja de 2-5 murino organotípicos retina culturas wholemount sobre la disociación, monocapa, retinospheroid o volver a agregar las culturas 3D esferoide 1 se encuentra en la preservación de las interacciones neuronales y las conexiones, imitando la situación in vivo. En comparación con informes anteriores 2, nuestro artículo de vídeo ofrece una demostración detallada de las peculiaridades de la enucleación de ojos murino y la disección de las retinas de las diferentes etapas de desarrollo incluyendo la eliminación de la lente y el cuerpo vítreo sin dañar la retina. La extracción del cristalino y el vítreo es esencial para la manipulación farmacológica, tanto en obstaculizar el acceso de las sustancias a las capas de la retina. A diferencia de otros sistemas murino informó explante cultura, no utilizamos materiales de apoyo, por ejemplo, membranas de policarbonato 2, de nuestra cultura organotípicos, pero la cultura de la flotación de la retina tazas wholemount libre, además de facilitar la accesibilidad de las sustancias aplicadas exógenamente 3-5.
Usando una química definida, el suero y complementar medio de cultivo libre sin la insulina permite que sólo a corto tiempo de cultivo (24 - 48 horas), pero contrarrestando los efectos de la insulina en 3 niveles de apoptosis o imitando el crecimiento del factor de efectos de FCS y se eviten los suplementos.
La mayoría de los estudios de apoptosis y proliferaciones utilizar los ensayos de MTT o FACS análisis para la cuantificación de los efectos. Nosotros, sin embargo, ofrecer un paso a paso la demostración de la disociación de las retinas de cultivo para la apoptosis y la proliferación cuantitativa análisis por cytospin. En cuanto a nuestra experiencia, el conteo manual de los núcleos en DAPI o manchas de células BrdU manchada - aunque tedioso y lento - es el método más preciso para la cuantificación de la apoptosis y la proliferación de la retina, especialmente en las retinas de murino.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a E. de la Rosa y Valenciano AI en busca de ayuda inicial con el establecimiento de los cultivos organotípicos y U. Laub y Gerster U. de asistencia técnica.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBS | Reagent | Sigma-Aldrich | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma-Aldrich | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma-Aldrich | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma-Aldrich | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma-Aldrich | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma-Aldrich | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Carl Roth Gmbh | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma-Aldrich | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma-Aldrich | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma-Aldrich | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche Group | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma-Aldrich | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | SERVA Electrophoresis | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma-Aldrich | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma-Aldrich | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | Falcon BD | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | Falcon BD | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand GmbH | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
References
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- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
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