In vivo-liknande Organotypic Murine Retinal Wholemount Kultur

Summary

Denna video artikeln visar inrättandet av organotypic retinal wholemount kulturer och en cytospin förfarande för analys av exogent inducerade effekter. Organotypic näthinnan wholemount kulturer härma

Abstract

Riktade ablationer av gener och analys av djurmodeller är den klassiska strategin för inskrivning specifika retinal geners funktion. Men transgena, näthinnan-specifika eller villkorlig knockout musmodeller visar ofta tidiga dödsfall eller lider av svåra missbildningar och förhindrar en analys bortom embryonala eller tidig postnatal stadier.

Primära cellkulturer är ett alternativ att undersöka effekterna av exogent tillämpas rekombinanta faktorer, överuttryck av gener eller siRNA-medierad gen ÖVERVÄLDIGANDE i en kontrollerad miljö. Dissocierade cellodling har fördelen att den endogena signalerna når målet cellerna minskar, vilket underlättar identifieringen av exogent utlöst effekter efter farmakologisk manipulation. Dock är viktiga cell-cell interaktioner initialt förstörts genom enzymatisk spjälkning eller mekaniska dissociation, även om re-aggregerade retinospheroid kulturer ¹ används.

Däremot organotypic retinala wholemount kulturer tillhandahålla ett system nära den fysiologiska in vivo-situationen med neuronala kontakter och anslutningar fortfarande bevarade ^2-5.

I denna video artikeln ger vi en steg för steg demonstration av (1) upprättande av in vivo-liknande organotypic retinal wholemount kulturer inklusive dissektion egenheter av embryonala, postnatal och vuxna murina ögon och (2) en dissociation och cytospin förfarande för analys av neuronala apoptos och retinal cellproliferation i organotypic wholemounts, t.ex. efter kulturen i närvaro av exogent tillämpas rekombinanta faktorer.

Protocol

All utrustning och reagenser måste köpas steril eller behöver värme eller ånga steriliseras eller steriliseras med 70% EtOH.

Författarna hävdar att experiment på djur har utförts i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv (86/609/EEG) i enlighet med riktlinjerna av NIH angående skötsel och användning av djur för försöksändamål förfaranden och de regler som anges av Institutional Animal Skötsel och användning kommittén (IACUC) vid universitetet i Duisburg-Essen (Tyskland).

Del 1: enucleation av murina ögonen på olika utvecklingsstadier

Enucleation av embryonala ögon

1. Tid gravid parningar sätts upp och på morgonen den dag då en vaginal plug upptäcks hos kvinnor parning är utsedd dräktighetens dag 0.
2. Den dräktiga offras av halsdislokation då utvecklingen av embryon har nått den önskade stadiet (här: embryonala dag (E) 15) och fasta på ett vax ombord ^6.
3. Bukväggen är fuktad med 70% EtOH, skär längs mittlinjen och huden klaffarna är fasta sidled stift ^6.
4. Den uterusses tas bort från buken, fristående och överförs till en bägare med kallt PBS ^6.
5. Embryona är separerade, överförs till en petriskål och livmoder väggen och embryonala membran avlägsnas försiktigt med hjälp av tång ^6.
6. Embryon dödas genom halshuggning.
7. Ögonen är enucleated vara användningen av fina, böjda pincett, "peeling" ögonen ur ögonhålan.

Enucleation av postnatal och vuxna ögon

1. Unga valpar dödas genom halshuggning, äldre ungar och vuxna med halsdislokation.
2. Upp till postnatal skede P15, den tid punkt när mössen öppna deras ögon, öga springor måste mekaniskt öppnas med hjälp av pincett och utvidgats med två tvärgående snitt i ögat lock med fjäder sax.
3. Ögonen är enucleated med hjälp av böjda pincett, ett tryck på banan.

Obs: Liksom vid födseln dag 2, den kretsande ben är fortfarande brosk, är det viktigt att inte för mycket tryck samtidigt som man försöker ta bort ögonen.
Däremot i den vuxna möss, orbital ben är fast. Således, för att enucleate ögonen räcker det att utöva påtryckningar på bana utan att förstora ögat slitsar i förväg.

Del 2: dissekering av embryonala, postnatal och vuxna murina näthinnor

Dissekering av näthinnor

1. Ögonen är placerade i en liten petriskål med sterilt PBS och den omgivande ögat lagren tas bort under en dissektion mikroskop.
2. För att ta bort det yttre ögat lager, i postnatala steg och vuxna ögon synnerven måste kapas med hjälp av vårens sax eller kläms av med pincett så nära grunden som möjligt.
3. Vänd ögat, så att baksidan med hål där synnerven ursprungligen bott mot dig. Skriv in subretinal utrymmet mellan näthinnan och pigmentepitel med tips på två mycket fina tång från den plats där synnerven trängde in i ögat lager.
   
   Obs: Vanligtvis kan pigmentepitel lätt identifieras genom sin mörka färg. I vissa mus muterade stammar - särskilt i albinodjur - detta pigment skikt får dock inte vara färgad och får därför inte vara lätt att upptäcka.
4. Ta bort pigmentepitel med den bifogade åderhinnan membranet och sklera genom att noga sliter på vardera sida med både pincett.
5. Dra av lagren upp till nivån av hornhinnan, vrid ögat koppen mot linsen och ta bort hornhinnan tillsammans med pigmentepitel, choroid membranet och sklera, medan du håller upp den återstående retinal koppen av den andra pincett.
6. Ta tag i glaskroppen tillsammans med den lilla linsen och samtidigt slita med pincett, hålla näthinnans wholemount på plats med den andra pincett.
   
   OBS: När dissekera embryonala ögon, se till att helt ta bort det trekantiga, tält-liknande kapillära plexus under glaskroppen tillsammans med glaskroppen.
   
   I den vuxna ögat behöver glaskroppen för att gripas på sidorna och omsorg måste tas inte ska ta hål i glaskroppen med tips av tång som dess innehåll är trögflytande och pinnar till pincett, hindrar dess avlägsnande.
7. För organotypic wholemount kultur näthinnans koppar samlas i en 96-brunnar innehåller 200 l Dulbecco ändrade örn medium (se nedan).

Notera: Mellan dissekering av enskilda näthinnor, hålla 96-bra samling platta innehållande odlingsmedium i inkubatorn som pH i substratet utlöses av CO ₂ via karbonatsystemet.

Del 3: Murine organotypic retinal wholemountkultur

1. Förbered 500 ml kulturen genom att vikta 7.8g Dulbecco ändrade örn på medellång / näringsämnen blandning F-12 HAM (DMEM) och 0.6g NaHCO ₃ och upplösning i både MiIliQ vatten. Justera pH till 7,15. Lägg till 50 mg apo-transferin, 50μl putrescin (lager: 60mg/ml), 50μl natriumselenit (lager: 52μg/ml), progesteron (lager: 60μg/ml) och 2,5 ml gentamicine (200 mm) under huven. Blanda och filtrera genom en flaska topp filter. Omedelbart före användning lägga 10μl glutamin (200 mm) per ml odlingsmedium.
   
   Notera: Detta serum-och insulin-fria medel kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 veckor och som används för försök apoptos induktion som inget insulin motverkar effekterna. Om inkubering av wholemounts längre än 24h önskas och celldöd priser kommer inte att utvärderas, insulinserumkoncentrationerna (t ex fetalt kalvserum, FCS) bör eller kosttillskott läggas för att förbättra överlevnaden.
2. Innan kultur, näthinnans wholemounts före inkuberas i 15 minuter vid 37 ° C med 200 l varm, pH-balanserad DMEM innehåller 0.5mg/ml hyaluronidas att i förväg smälta hyaluronidas innehåller inre och yttre begränsande membran av M ller Glia celler, underlätta penetration av exogent tillämpade ämnen.
3. Näthinnor överförs till en 24-brunnar med så få hyaluronidas som möjligt och odlade som organotypic wholemounts i 2ml kemiskt definierade Dulbecco ändrade örn medium.
   
   Obs: För att överföra näthinnor, använda en 1 ml pipett och skär pipettspetsen några millimeter för att vidga öppningen. För embryonala ögon, är en 200 l pipettspets tillräcklig. Skären bör jämnas genom införande och vridning av en sekund pipettspetsen.
   I 24-48 timmar korta kulturer, kan alla steg utförs på bänken, men om förorening av kulturer visar sig vara ett problem, bör man arbeta under huven.
4. Kulturer bevaras för 24 - 48 timmar vid 37 ° C i en 5% CO ₂ atmosfär och t.ex. utsätts för farmakologisk behandling med rekombinant faktorer.

Del 4: Dissociation av odlade retinal wholemounts

1. Efter att den önskade kulturen tiden, näthinnor samlas i 2 ml Eppendorf-rör med rund botten som innehåller 850 l PBS och 50 l Nötkreaturserum albumine (BSA, 30 mg / ml).
2. Placera Eppendorf rör med näthinnor i ett värmeblock, värms upp vid 37 ° C.
3. Tillsätt 25 l kollagenas (200 E / ml) och 25 l hyaluronidas (20mg/ml) till varje Eppendorf-rör och börja ta avstånd till näthinnor i enskilda cellsuspension med 3 passerar genom en silikoniserad pasteurpipett.
4. Tillsätt 10 l trypsin (1mg/ml), vänta i 3-5 minuter, och sedan långsamt pipett 3-5 gånger upp och ner med silikoniserad pasteurpipett att mekaniskt skilja vävnaden.
5. Tillsätt 10 l DNase I (5mg/ml), återigen vänta 3-5 min, sedan långsamt pipett 3-5 gånger upp och ner med silikoniserad pasteurpipett.
   
   OBS: Inkubationstiden för enzymatisk dissociation varierar och beror på storleken på ögon och utvecklingsstadiet, respektive. Kontrollera hur långt enzymatisk spjälkning av vävnad genom att försiktigt pipettera upp och ned.
6. Om cellsuspension inte är homogen vid det här laget men fortfarande innehåller stora cellaggregat, lägga till ytterligare 10 l trypsin och 10 l DNas I.
7. När cellsuspension är homogen, är nedbrytning av vävnaden stoppas genom tillsats av 10 l EDTA (0,5 m), är Eppendorf-rör bort från kaminen och suspensioner celler fastställs för 1h genom tillsats av 1 ml färsk, iskall 8% paraformaldehyd (PFA) i rumstemperatur på en rotation shaker.

Del 5: Tvättning av dissocierade cellsuspensioner

1. Cellsuspensionen centrifugeras i 5 minuter vid 4 ° C och 0,2 RCF i en kyl centrifug.
2. Supernatanten är kasseras och pellets är resuspenderas i 1 ml PBS innehållande 3mg/ml BSA.
3. Efter att upprepa dessa tvätt stegen två gånger, är pellets äntligen resuspenderas i 500 l PBS innehållande 3mg/ml BSA, 5mm EDTA och 0,1% natriumazid.

Obs: tillsats av natrium syra tillåta lagring av cellsuspensionen i flera dagar vid 4 ° C. Men om en immuncytokemiska färgning kommer att följa, inte lägga natrium syra på resuspension buffert, eftersom detta resulterar i förlust av färgning kvalitet.

Del 6: Cytospin av cellsuspensioner för kvantitativa apoptos och proliferation analys

1. Ett frostat slut objektglas, en cytospin filter med en eller två hål och en cytospin tratt förs in en cytospin bild klipp. Bilden klippet är stängd och placerad i cytospin rotorn.
2. Det dissocierade cellsuspension är homogeniseras genom att försiktigt pipettera upp och ned.
   
   Obs: Beroende på utvecklingsstadiet av näthinnan, kan cellen avstängning från dissociationen förfarande börspädas med PBS för att få en uppräknelig antal celler.
3. En alikvot (100 l) av cellsuspensionen tillämpas på ett cytospin tratt.
   
   OBS: När pipettera cellsuspensionen till tratten bör toppen av pipetten når hela vägen ner till botten av tratten. Det är viktigt att inte driva igenom den andra tryckpunkten av pipetten som detta skapar luftbubblor som kommer att synas i cellen plats efter cytospin och hämmar celler.
4. Cellsuspensionen är fläckig på en bild på 700 rpm för 7 min.
5. För att fastställa effekten av exogent tillämpas faktorer på apoptos nivåer celler kan färgas med 4 ',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, 2μg/ml), monterad med fluorescerande monteringsmedel. Förändringar i cellen apoptos kan bestämmas genom att räkna minst 1000 celler (varav minst 10 pycnotic kärnor) i cytospin cellen fläckar och celldöd beräknas som procent av totala celler räknas ^3,4.
   
   Obs: Alternativt kan fördelningen av apoptotiska kärnor utvärderas flatmounts ³ eller kryostat sections4 av odlade retinal wholemounts av TdT-medierad dUTP nick slutet märkning (Tunel).
6. För detektion av cellproliferation kan BrdU (5 M) läggas 6h före slutet av den kultur och BrdU inbyggnad visualiseras i cytospins av cell homogenat med immuncytokemiska färgning med en anti-BrdU antikropp (t.ex. utvecklingsstudier Hybridoma Bank, Iowa, USA).
7. Effekten av behandling på olika näthinnan celltyper kan visualiseras i cytospins av neuron specifika antikroppar som Brn3a (gangliecell markör) eller opsin (fotoreceptor markör) och motfärgning med DAPI.

Del 7: representativa resultat

Figur 1: Olika steg i förberedelserna av murina organotypic retinal wholemounts
En chef för musen med båda ögonen. B Murine öga med lins uppåt, alla lager kvar. C Murine ögat från baksidan med synnerven fortfarande sitter. D Murine öga med sklera och pigmentepitel delvis tas bort. E Murine näthinnan med hornhinna, sklera och pigmentepitel bort helt, men linsen och glaskroppen kvar. F Murine retinala wholemount kopp med linsen och glaskroppen tas bort. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Figur 2: Analys av organotypic retinal wholemount kulturer med cytospin och sektioner
För analys av apoptos, är cytospins av dissocierade cellsuspensioner färgas av DAPI och pycnotic kärnor kan särskiljas genom kärnkraft fragmentering eller kromatin kondens (pilspetsar i A). Alternativt wholemount sektioner (CE; murina näthinnan efter födsel dag (P) 2) eller retinala flatmount (F) kan bli föremål för en Tunel analys och counterstained med DAPI (E). Effekten av behandling på olika näthinnan celltyper kan visualiseras i cytospins av neuron specifika antikroppar som gangliecell markör Brn3a (pilar i B) GCL, ganglion cellager;. INL, blivande inre kärnkraft lager. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.

Discussion

Fördelen med murina organotypic retinal wholemount kulturer ^2-5 över dissociation, monolager, retinospheroid eller återexporteras aggregerade 3D ​​sfäroid kulturer ¹ ligger i bevarandet av neuronala interaktioner och anslutningar, härma in vivo-situationen. I jämförelse med tidigare rapporter ^2, ger vår video artikeln en ingående demonstration av de egenheter i enucleation av murina ögon och dissekering av näthinnor i olika utvecklingsstadier, inklusive borttagning av lins och glaskropp utan att skada näthinnan. Borttagandet av linsen och glaskroppen är en förutsättning för farmakologiska manipulationer som både hindrar tillträde ämnen till näthinnans lager. I motsats till andra rapporterade murina system Explantation kultur, använder vi inte stödjande material, t.ex. polykarbonat membran ^2, för våra organotypic kultur, men kulturen näthinnans wholemount koppar fritt flytande, dessutom underlättar tillgängligheten för exogent tillämpade ämnen ^3-5.

Med hjälp av en kemiskt definierade, serum-och komplettera-fri kultur medium utan insulin tillåter endast för kort tid kultur (24 - 48 timmar), men att motverka effekterna av insulin på apoptos nivå ³ eller tillväxtfaktor-imitation effekterna av FCS och tillägg undviks.

De flesta apoptos och proliferations studier använder MTT analyser eller FACS analys för kvantifiering av effekter. Vi dock ge en steg för steg demonstration av dissociation av odlade näthinnor för kvantitativa apoptos och proliferation analys av cytospin. När det gäller vår erfarenhet går, manuell räkning av kärnor i DAPI eller BrdU färgade fläckar cell - är den mest exakta metoden för att kvantifiera retinal apoptos och spridning, särskilt i murina näthinnor - även tråkiga och tidskrävande.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Animal	Charles River Laboratories
Dissection microscope	Tool	Carl Zeiss, Inc.
PBS	Reagent	Sigma-Aldrich		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham	Reagent	Sigma-Aldrich	D 8900	DMEM / F-12
Apo-transferin	Reagent	Sigma-Aldrich	T 1147
Putrescin	Reagent	Sigma-Aldrich	P 5780
Sodium selenite	Reagent	Sigma-Aldrich	S 9133
Progesterone	Reagent	Sigma-Aldrich	P 6149
Gentamicine	Reagent	Invitrogen
L-Glutamine	Reagent	Invitrogen	25030-024	200 mM (100X), liquid
Bovine serum albumine (BSA)	Reagent	Carl Roth Gmbh	8076.3	30 mg/ml
Collagenase	Reagent	Sigma-Aldrich	C 0773	200 U/ml
Trypsin	Reagent	Sigma-Aldrich	T4799	From porcine pancreas; 1 mg/ml
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H 3884	200 mg/ml
DNase I	Reagent	Roche Group	1 284 932	10 mg/ml
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E 6511
Silicone solution	Reagent	SERVA Electrophoresis	35130
Paraformaldehyde (PFA)	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).
4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Reagent	Sigma-Aldrich	D 0542	DAPI
Fluorescent Mounting Medium	Reagent	Dako	S3023
BrDU	Reagent	Sigma-Aldrich	B 9285
96-well plates	Tool	Falcon BD	3072
24-well plates	Tool	Falcon BD	3047
Pasteur pipettes	Tool	Brand GmbH	747720
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors,straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin
Cooling centrifuge	Tool	Eppendorf
Rotation shaker	Tool	CAT
Cytospin	Tool	Thermo Fisher Scientific, Inc.