Summary
هنا نبين كيفية القيام الرجعية المدارية الحقن في الزرد الكبار.
Abstract
العلاج من تعاطي المخدرات من الحيوانات كله هو أداة أساسية في أي نظام نموذجي للدراسات الجينية الدوائية والكيميائية. الوريد (IV) الحقن وغالبا ما يكون الوسيلة الأكثر فعالية وموسع للتسليم وكيلا للاهتمام. في الزرد (
Protocol
الجزء 1. إعداد مواد الحقن
- TG (غلوبين : GFP) الخلايا :
- تنزف الكبار الأسماك باستخدام المانحة 10ul غيض ماصة المغلفة في الهيبارين (1unit/ul) للأسماك وراء ثقب الخيشومية.
- نضح خلايا الدم الحمراء والاستغناء العازلة في الخلية (PBS 0.9X + 5 ٪ + FBS القلم 1 ٪ / بكتيريا).
- التعليق على تصفية خلية شبكة 40uM وتحديد تركيز الخلايا باستخدام عدادة الكريات كما هو موضح سابقا لوبلان وآخرون.
- تدور في أسفل وresuspend العازلة التركيز المطلوب في الخلية بحيث النهائي حجم الحقن ليست أكثر من 5ul. نحن هنا حقن الخلايا 1،5-2٬000٬000 / المتلقي.
- ل، ديكستران ® الأحمر ولاية تكساس ، في إذابة الصبغة DPBS لحقن تركيز النهائي من 10-12 ملغ / مل. خطة لضخ 4 UL في الأسماك.
الجزء 2. حقن
- تخدير الأسماك في tricaine (4.2ml الأسماك tricaine/100ml (4mg/ml) الماء).
- غسل هاميلتون حقنة 3-4 مرات قبل الحقن باستخدام الايثانول 70 ٪. شطف 3-4 مرات مع DPBS 0.9X.
- مكان الأسماك الجانب الظهري صعودا وتواجه الحق على اسفنجة رطبة.
- عقد المحقنة هاميلتون مع يدك اليمنى ومع السبابة الخاص بك على المكبس. استقرار الجسم بلطف من الاسماك مع يدك اليسرى.
- موقف إبرة مع شطبة مواجهة بحيث لو عين السمكة ليالي كانت مدار الساعة ، والإبرة سيكون لافتا في موقف 7:00 و بزاوية 45 درجة للأسماك (الشكل 1).
- ادخال الإبرة بلطف 1-2 ملم في 7:00 الموقف وتخفض ببطء الغطاس.
- السماح للأسماك في المياه لاسترداد E3 الطازجة.
- غسل الإبرة ، على النحو الموصوف أعلاه ، وبين حقنا من الكواشف المختلفة.
- نفض الغبار حل الخلية إلى الخلايا resuspend كل بضع دقائق لمنع تكتل الخلية.
- إبقاء الأسماك قبالة تدفق لل1 الاسبوع مع تغيير الماء يوميا لتجنب العدوى. واصلنا الأسماك في المياه وحدة العناية المركزة لهذه الفترة (10ML معطف الإجهاد + + pemafix 5mL melafix 5mL لكل لتر ماء 38 E3).
الجزء 3. ممثل النتائج
عندما يقوم بشكل صحيح ، فمن الممكن تصور المادة إذا كان قد تم حقنه تسميته في بعض الطريق. على سبيل المثال ، تيراغرام (غلوبين : GFP) ينبغي أن ينظر إلى خلايا الدم الحمراء تحت المجهر تشريح الفلورسنت المتداولة في الأوعية الدموية للأسماك كاسبر المتلقي قريبا بعد الحقن كما هو مبين في الشكل 2. وبالمثل ، يمكن حقن ديكستران 70kDa ، مترافق الى تكساس الأحمر ® يمكن تصور في الأوعية الدموية للأسماك شفافة مباشرة بعد الحقن الرجعية المدارية (الشكل 3). خلايا الكلى من الفلورسنت تيراغرام (β - أكتين : GFP) ويمكن أيضا أن تحقن الأسماك المانحة الرجعية orbitally المشع في كاسبر الأسماك المستفيدة. وهذه الخلايا في نهاية المطاف إلى المنزل نخاع المتلقي (الشكل 4A) ، وربما يذهب بعد ذلك الى اعد اسكان الكلى بعد عدة أسابيع (الشكل 4B).
إذا كان الحقن ضحل جدا أو زاوية الإبرة يتجاوز الجيب الوريدي الرجعية جوف الحجاج ، قد حقن المواد يمكن تصور تجمع حول العين او تدفق للخروج منه. بدلا من ذلك ، إذا كان الحقن العميق جدا ، قد الأسماك تجربة تلف الأنسجة أو النزيف ، على الرغم من أنها قد لا يزال يتعافى. عندما يقوم بشكل صحيح ، يجب أن معدل وفيات بعد الرجعية المدارية الحقن يكون أقل من 5 ٪ من مجموع السمك حقن ونجاح التسليم إلى مجرى الدم يجب أن تكون أكبر من 90 ٪ من مجموع السمك حقن.
الشكل 1 : رسم توضيحي للتقنية الحقن الرجعية المداري. ويمثل العين اليمنى من الاسماك كساعة التماثلي الذي كرامي seven موقف يتوافق مع البقعة الحقن الصحيح.
الشكل 2 : تيراغرام (غلوبين : GFP) خلايا الدم الحمراء في الأوعية الدموية المنتشرة في ذيل سمكة كاسبر الكبار بعد ثلاثة أيام من الرجعية المدارية الحقن.
الشكل 3 : حقن الناجح لديكستران 70kDa مترافق الأحمر إلى ولاية تكساس ® تستخدم صبغة الفلورسنت تنتج الأوعية الدموية في الأسماك البالغة شفافة ، كاسبر وينظر بسهولة باستخدام معيار المجهري مضان كل الحيوانات.
الشكل 4A : ثلاثة أيام التالية الرجعية المدارية حقن خلايا نخاع الكلى كله من تيراغرام (β - أكتين : GFP) الأسماك المانحة ، وخلايا يمكن تصور صاروخ موجه للنخاع الكلى المشع الكبار كاسبر الأسماك المستفيدة.
شخصية4B : أربعة أسابيع بعد الرجعية المدارية حقن خلايا نخاع الكلى كله من تيراغرام (β - أكتين : GFP) الأسماك المانحة ، وإعادة تعمير الكلى المتلقي مع الجهات المانحة كلها خضراء خلايا نخاع الكلى يمكن تصور أخلاقي المشع في كاسبر الأسماك المستفيدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الرجعية المدارية الحقن في الزرد الكبار يعطي أعلى كفاءة تسليم المواد الى مجرى الدم حقن مع أدنى معدل للوفيات. نظرا لطبيعة المكان الحقن ، وثقب ويبدو أن تلتئم بسرعة ، والحد من حدوث العدوى وكمية من فقدان الدم. بل قد تكون في موقع حقن مرارا خلال فترة زمنية قصيرة لحقن يومية من الأدوية ، على سبيل المثال.
يجب شراء كميات كبيرة من المخدرات لطرق العلاج التقليدية في الأسماك البالغة التي الأسماك مغمورة ببساطة وغارقة في المياه التي تحتوي على المخدرات من اهتمام. ومع ذلك ، إذا تم حقن الدواء مباشرة في مجرى الدم من الحيوان ، وهناك حاجة إلى كمية أقل من ذلك بكثير لتلقي العلاج ، وبالتالي تقليل التكاليف التجريبية. لبعض المركبات التي تكون كبيرة جدا لدخول تداول الأسماك من خلال تمرغ في حالة من الببتيدات معينة ، قد الرجعية المدارية حقن أيضا أن تكون مفيدة.
كذلك ، لأن الحقن ريال عماني هو أسرع وأسهل من تقنيات الحقن داخل القلب في الأسماك الكبار ، وآخر قد طلب من ريال عماني وتشمل الحقن البالغين الفحص الكيميائي الجينية. وبالتالي ، قد الرجعية المدارية الحقن تسهل كثيرا البحث الزرد الكيميائية أو المواد الكيميائية التي تتطلب التسليم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويؤيد هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي ومنحة من المعاهد الوطنية للصحة لدراسة تكون الدم الجنيني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
