Summary
在这里，我们展示如何在成年斑马鱼眼窝注射。
Abstract
整体动物药物治疗是一种必不可少的工具，在任何药理和化学遗传研究的模型系统。静脉（IV）注射液往往是最有效和无创性的形式利益的代理人交付。在斑马鱼（
Protocol
第1部分。注射材料的制备
- TG（ 珠 ：GFP）细胞：
- 出血成人捐助鱼用10ul枪头涂肝素（1unit/ul）穿刺背后刺鱼。
- 吸红血细胞和免除在细胞液（0.9倍PBS + 5％FBS + 1％笔/链球菌）。
- 超过40uM网过滤细胞悬液，并确定使用血球细胞作为先前由勒布朗等浓度。
- 降速和重新悬浮细胞缓冲所需浓度，这样最后的注射量不超过5ul。在这里，我们注入1.5-2万个细胞/收件人。
- 右旋糖酐，德克萨斯红®，染料溶解在最后的注射浓度为10-12毫克/毫升的DPBS 。计划注入鱼微升4％。
第2部分。注塑
- 麻醉tricaine鱼（4.2毫升（4mg/ml）tricaine/100ml鱼水）。
- 洗汉密尔顿注射器注射前用70％乙醇的3-4倍。与0.9倍DPBS冲洗3-4次。
- 将鱼背侧和面临的湿海绵权。
- 握住你的右手，用你的食指上的柱塞汉密尔顿注射器。用左手轻轻地稳定鱼的身体。
- 面对这种鱼的眼睛，如果是一个时钟，将针指向在7:00的位置，并在45度角的鱼（图1）锥针的位置。
- 轻轻插入针1-2毫米到7:00的位置，并慢慢压低柱塞。
- 让鱼恢复在E3的新鲜水。
- 洗针，如上所述，注射不同试剂之间，。
- 弗里克细胞重新悬浮细胞，每隔几分钟，以防止细胞聚集的解决方案。
- 保持每天换水过流鱼，以避免感染1周。我们保持此期间在ICU水的鱼（10毫升压力大衣+ 5ML pemafix + E3的水每38公升的5ML melafix）。
第3部分。代表性的成果
当正确执行，这是可能的可视化注射材料，如果它已经以某种方式标记。例如，TG（ 珠 ：GFP）的红细胞应被视为根据荧光显微镜清扫循环收件人卡斯帕尔鱼的血管中注射后不久，如在图2所示。同样，一个70kDa的葡聚糖，共轭得克萨斯红 ®注射可以可视化的透明鱼紧随复古入轨（图3）血管。从TG（β-肌动蛋白 GFP）的荧光肾细胞也可以注射捐助鱼复古轨道进入辐照卡斯帕尔收件人鱼。这些细胞最终会到收件人的骨髓（图4a）和可能去重新填充后几个星期肾（图4b）。
如果注射太浅，或进针角度绕过眼窝静脉窦腔，注射材料可能是眼部周围的可视化池或流淌出来。另外，如果注射过深，鱼可能会遇到的组织损伤或出血过多，但他们仍然可以恢复。当正确执行，复古入轨后的死亡率应低于5％的总注入鱼和成功运送到血液中，应大于90％的总注入鱼。
图1：眼窝注射技术插图。鱼的右眼被表示为一个模拟时钟七点钟位置对应正确的注射部位。
图2：TG（ 珠：GFP）的红血细胞， 成人卡斯帕尔鱼眼窝注射后三天的尾部血管循环。
图3：成功注入一个70kDa的葡聚糖结合德克萨斯红染料产生荧光血管透明的成鱼 ，卡斯帕尔和随时查看，使用标准的整个动物荧光显微镜使用®。
图4a：三天，整个肾脏从TG（β-肌动蛋白GFP）的骨髓细胞注射后眼窝捐助鱼，可以可视化归巢辐照成人卡斯帕尔收件人鱼肾骨髓细胞。
图4B：照射成人卡斯帕尔收件人鱼眼窝整个肾脏从TG（β-肌动蛋白 GFP）的骨髓细胞注射捐助鱼，复育与绿色捐助整个肾骨髓细胞的收件人肾以下四个星期可以在可视化。
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Discussion
在成年斑马鱼的眼窝注射使注射材料交付的效率最高，血液中的死亡率与发病率最低。由于注射部位的性质，出现穿刺愈合快，减少发生感染和出血量。该网站甚至可能被多次注入在一个短的时间内每天注射药物，例如。
在这种鱼是简单的浸泡和浸泡在含有药物的利息的水成鱼的传统治疗方法，必须购买大量毒品。然而，如果药物直接注入动物的血液，一个更小的数量是需要治疗，从而降低了实验成本。对于某些化合物，通过浸泡在某些肽的情况下，进入流通鱼太大，眼窝注射也可能是有利的。
此外，由于反渗透注射速度更快，比腔内注射技术，成鱼更容易，反渗透注射的另一个应用程序可能包括成人化学基因筛查。因此，后眼窝注射可能会大大促进斑马鱼的研究，要求化学或化学交付。
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Acknowledgments
这项工作是霍华德休斯医学研究所和美国国立卫生研究院研究胚胎造血授予的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
