Summary
Hier laten we zien hoe retro-orbitale injectie te doen in volwassen zebravissen.
Abstract
Medicamenteuze behandeling van hele dieren is een essentieel instrument in een modelsysteem voor farmacologische en chemische genetische studies. Intraveneuze (IV) injectie is vaak de meest effectieve en niet-invasieve vorm van levering van een agent van belang. Bij de zebravis (
Protocol
Deel 1. De voorbereiding van de injectie materiaal
- Tg (globine: GFP) cellen:
- Bleed volwassen donor vis met behulp van 10ul pipetpunt coating in heparine (1unit/ul) om het doorprikken vissen achter kieuw.
- Zuig rode bloedcellen en afzien in cel buffer (0,9 x PBS + 5% + 1% FBS Pen / Strep).
- Filter celsuspensie over 40uM mesh en bepaal de concentratie van cellen met behulp van hemocytometer zoals eerder beschreven door Leblanc et al..
- Spin down en resuspendeer in cel buffer op de gewenste concentratie zodanig dat uiteindelijk injectievolume niet meer dan 5ul. Hier hebben we injecteren 1.5-2 miljoen cellen / ontvanger.
- Voor de dextran, Texas Red ®, Los de kleurstof in DPBS voor een laatste injectie concentratie van 10-12 mg / ml. Van plan om 4 uL per vis injecteren.
Deel 2. Injectie
- Verdoven vis in tricaïne (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml vis water).
- Was Hamilton spuit 3-4 keer voorafgaand aan de injectie met 70% ethanol. Spoel 3-4 keer met 0.9x DPBS.
- Leg vis dorsale zijde naar boven en naar rechts op vochtige spons.
- Houd de Hamilton spuit met je rechterhand en met je wijsvinger op de zuiger. Voorzichtig stabiliseren het lichaam van de vis met je linkerhand.
- Plaats de naald met de schuine rand naar boven zodanig dat als de vis s oog werden een klok, de naald zou zijn gericht op de 7:00 positie en in een hoek van 45 graden om de vis (figuur 1).
- Steek de naald 1-2 mm in 7:00 positie en langzaam op de zuiger.
- Laat de vis te herstellen in zoet water E3.
- Was naald, zoals hierboven beschreven, tussen de injecties van verschillende reagentia.
- Flick cel oplossing voor hersuspenderen cellen om de paar minuten naar cel klonteren te voorkomen.
- Te houden vis uit stroom voor 1 week met dagelijkse waterverversingen om infectie te voorkomen. We blijven vissen in ICU water voor deze periode (10 ml Stress jas + 5 ml pemafix + 5 ml melafix per 38 liter water E3).
Deel 3. Representatieve resultaten
Bij het correct wordt uitgevoerd, is het mogelijk om geïnjecteerde materiaal te visualiseren als het is gelabeld of andere manier. Bijvoorbeeld, Tg (globine: GFP) moet de rode bloedcellen te zien onder een tl-dissectie microscoop circuleert in het vaatstelsel van de ontvanger casper vis vlak na injectie zoals weergegeven in figuur 2. Ook kan de injectie van een 70kDa dextran, geconjugeerd met Texas Red ® worden gevisualiseerd in het vaatstelsel van de transparante vis onmiddellijk na retro-orbitale injectie (figuur 3). Fluorescerende niercellen van Tg (β-actine: GFP) donor vis kan ook retro-orbitaal worden geïnjecteerd in bestraald casper ontvanger vis. Deze cellen zullen de thuishaven van de ontvanger beenmerg (figuur 4a) en uiteindelijk kan gaan vervolgens in op de nier herbevolken na enkele weken (figuur 4b).
Als de injectie is te ondiep of de hoek van de naald omzeilt de retro-orbitale veneuze sinus holte, kan geïnjecteerde materiaal worden gevisualiseerd bundelen rond de ogen of stromende van te maken. Als alternatief, als de injectie is te diep, kunnen vissen ervaren weefselbeschadiging of overmatig bloeden, hoewel ze nog steeds kunnen herstellen. Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, moet mortaliteit na retro-orbitale injectie minder dan 5% van het totaal geïnjecteerde vissen en het succes van levering aan de bloedbaan moet meer dan 90% van het totaal ingespoten vis.
Figuur 1: Illustratie van retro-orbitale injectietechniek. Het rechter oog van de vis wordt voorgesteld als een analoge klok, waarin de zeven positie komt overeen met de juiste injectie plek.
Figuur 2: Tg (globine: GFP) rode bloedcellen circuleren in het vaatstelsel van de staart van een volwassen vis casper drie dagen na de retro-orbitale injectie.
Figuur 3: Succesvolle injectie van een 70kDa dextran geconjugeerd aan Texas Red ® gebruikt als kleurstof produceert fluorescerende bloedvaten in de transparante volwassen vissen, Casper en gemakkelijk bekijken met behulp van standaard hele dier fluorescentie microscopie.
Figuur 4a: Drie dagen na de retro-orbitale injectie van hele nieren beenmerg cellen van Tg (β-actine: GFP) donor vis, de cellen kunnen worden gevisualiseerd homing aan de nieren merg van bestraalde volwassen casper ontvanger vis.
Figuur4b: Vier weken na de retro-orbitale injectie van hele nieren beenmerg cellen van Tg (β-actine: GFP) donor vissen, de herbevolking van de ontvanger nier met groene donor nier hele beenmerg cellen kunnen worden gevisualiseerd in bestraald volwassen Casper ontvanger vis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retro-orbitale injectie in volwassen zebravissen geeft het hoogste rendement van de levering van het geïnjecteerde materiaal naar de bloedbaan met de laagste incidentie van mortaliteit. Vanwege de aard van de injectie plek, het lek lijkt te snel te genezen, het verminderen van het voorkomen van besmetting en de hoeveelheid bloedverlies. De site kan zelfs meerdere malen geïnjecteerd worden gedurende een korte tijd voor de dagelijkse injecties met medicijnen, bijvoorbeeld.
Grote hoeveelheden drugs moet worden gekocht voor traditionele behandelmethoden in volwassen vis in die vis gewoon ondergedompeld en geweekt in water met daarin het middel van belang. Echter, als het geneesmiddel wordt direct geïnjecteerd in de bloedbaan van het dier, is een veel kleinere hoeveelheid die nodig is voor de behandeling, waardoor dalende experimentele kosten. Voor bepaalde stoffen die te groot zijn om de vis bloedsomloop binnenkomen via het weken, in het geval van bepaalde peptiden, kan retro-orbitale injectie ook voordelig zijn.
Verder, omdat RO injectie is sneller en eenvoudiger dan intracardiale injectie technieken in de volwassen vissen, kan een andere toepassing van RO injectie onder volwassen chemische genetische screening. Zo kunnen retro-orbitale injectie aanzienlijk vergemakkelijken zebravis onderzoek waarbij chemische of chemische levering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door Howard Hughes Medical Institute en een subsidie van de NIH voor de studie van de embryonale hematopoiese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
