Summary
여기 우리는 성인 zebrafish에서 역전사 궤도 주사를하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
전체 동물의 약물 치료 약리 화학 유전 연구에 대한 모델 시스템에 필수적인 도구입니다. 정맥 주사 (IV) 주사가 종종 관심의 대리인의 전달의 가장 효과적이고 비침 투 형태입니다. zebrafish에서 (
Protocol
1 부. 사출 재료의 준비
- TG (globin : GFP) 세포 :
- 길 뒤에 찔린 물고기 헤파린 (1unit/ul)에 코팅 10ul 피펫 팁을 사용하여 성인 기증자 물고기 출혈.
- 적혈구를 기음과 셀 버퍼에 분배 (0.9X PBS + 5% FBS + 1 %의 펜 / Strep).
- 필터 셀 40uM 메쉬 이상의 정지 및 이전 르블랑 외 의해 설명한대로 hemocytometer를 사용하여 세포의 농도를 결정한다.
- 스핀 다운 및 최종 사출 량이 5ul 이상 없다는 등 원하는 농도에서 세포 버퍼에 resuspend. 여기 1.5-2000000 세포 /받는 사람을 주입.
- dextran, 텍사스 레드 ® 들어, 10-12 MG / ML의 최종 주입 농도에 대한 DPBS에 염료를 해산. 물고기마다 네 UL을 주입 계획입니다.
2 부. 주사
- (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml 물고기 물) tricaine 물고기를 마취.
- 와시 해밀턴 주사기 이전 70 % 에탄올을 사용하여 주사하는 3-4 회. 0.9X DPBS로 3-4 회 린스.
- 플레이스 최대 생선 등의 측면과 젖은 스폰지에 바로 직면.
- 오른손과 플런저에 검지 손가락으로 해밀턴 주사기 들고. 천천히 왼쪽 손으로 물고기의 시체를 안정화.
- 물고기의 눈이 시계라면, 바늘이 7시 위치와 물고기 (그림 1)에 45도 각도 가리키는 것이 같은를 직면하고있는 베벨과 바늘을 위치.
- 부드럽게 7시 위치에 바늘 1~2밀리미터를 삽입하고 천천히 플런저를 우울.
- 신선한 E3 물에 복구하는 물고기를 허용합니다.
- 다른 시약의 주사 사이에 위에서 설명한 바와 같이, 바늘을 씻으십시오.
- 셀 clumping을 방지하기 위해 세포마다 몇 분 resuspend에 플릭 셀 솔루션입니다.
- 감염을 피하기 위해 매일 물을 변경 1 주일 동안 흐름에서 생선 보관하십시오. 우리는 (10mL 스트레스 코트 + 5mL pemafix + 38리터 E3 물 당 5mL melafix)이 기간 동안 ICU 소금물에 생선을 보관.
부 3. 대표 결과
제대로 수행하면, 그것이 어떤 식으로든 표시되었는지 주입 자료를 시각화 할 수 있습니다. 예를 들어, TG (globin : GFP) 적혈구는 그림 2와 같이 빨리 주입 후받는 캐스퍼 물고기의 vasculature의 순환 형광등 해부 현미경 아래에서 볼 수 있습니다. 마찬가지로, 텍사스 레드 ®에 복합 70kDa dextran의 주입은 역전사 궤도 분사 바로 다음에 투명 물고기 (그림 3)의 vasculature에 시각하실 수 있습니다. TG (β - 굴지 : GFP)에서 형광 신장 세포 기증자 물고기도 조사 캐스퍼받는 생선으로 역전사 orbitally 주입 수 있습니다. 이 세포는 결국 다음 몇 주 (그림 4B) 후 신장을 repopulate하기 위해받는 사람 골수 (그림 4A)로 가정에 갈 수 있습니다.
주사가 너무 얕은하거나 바늘의 각도는 복고풍 - 궤도 정맥 부비동의 캐비티를 무시하는 경우, 주입 물질은 눈 주위 풀링 또는 밖으로 흐르는 시각 수 있습니다. 주사가 너무 깊은 경우 그들은 여전히 복구할 수 있지만 또한, 물고기, 조직 손상이나 과도한 출혈이 발생할 수 있습니다. 제대로 수행되면, 복고풍 - orbital은 주사 후 사망률 총 주입 생선과 혈류에 납품 성공의 5 % 이하의 총 주입 물고기보다 90 % 이상되어야한다.
그림 1 : 역전사 궤도 분사 기법의 일러스트 레이션. 물고기의 오른쪽 눈은 일곱 O 클럭 위치가 올바른 주사 장소에 해당하는 아날로그 시계로 표현된다.
그림 2 : TG (globin : GFP) 삼일 역 궤도 분사 이후 성인 캐스퍼 물고기의 꼬리 vasculature에 순환 적혈구.
그림 3 : 레드 텍사스에 복합 70kDa dextran ® 염료는 투명 성인 생선, 캐스퍼의 형광 vasculature을 생산하고 쉽게 표준 전체 동물의 형광 현미경을 사용하여 볼로 사용 성공적으로 주입.
그림 4A : TG (β - 굴지 : GFP)의 전체 신장 골수 세포의 복고풍 - 궤도 분사 다음과 같은 세 가지 일 기증자 물고기, 세포가 조사 성인 캐스퍼받는 물고기의 신장 골수에 돌입 시각하실 수 있습니다.
그림4B : TG (β - 굴지 : GFP)의 전체 신장 골수 세포의 복고풍 - 궤도 분사 다음 4 주 기증자 생선, 녹색 기증자 전체 신장 골수 세포로받는 신장의 repopulation이 조사 성인 캐스퍼받는 물고기의 시각하실 수 있습니다.
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Discussion
성인 zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사는 사망률의 가장 낮은 발병률과 혈류에 주입 물질의 전달 가장 높은 효율을 제공합니다. 때문에 분사 지점의 성격, 주사 감염과 혈액 손실 금액의 발생을 감소 신속하게 치유가 나타납니다. 사이트도 반복 예를 들어, 약물의 매일 주사를위한 짧은 시간 동안 주입 수 있습니다.
약물의 다량은 간단하게 포장되어과 관심의 약물을 포함하는 물에 배어있는 물고기의 성인 물고기의 전통적인 치료 방법에 대한 구입하셔야합니다. 약물이 동물의 혈액에 직접 주입하는 경우 그러나, 훨씬 작은 수량은이를 실험 비용을 줄이는 치료를 위해 필요합니다. 특정 펩티드의 경우에 몸을 담글 수를 통해 물고기 순환을 입력하기에는 너무 큰 특정 화합물 들어, 복고풍 - 궤도 분사도 유리한 수 있습니다.
RO 주사는 성인 물고기의 intracardiac 사출 기술을보다 빠르고 쉽게이기 때문에 또한, RO 주사의 또 다른 응용 프로그램이 어른 화학 유전자 검사를 포함할 수 있습니다. 따라서, 역 궤도 분사 크게 화학적 또는 화학적 전달을 필요로 zebrafish 연구를 용이하게 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소와 배아 조혈 연구에 대한 NIH에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
