Summary
Aquí te mostramos cómo hacer retro-orbital de la inyección en adultos de pez cebra.
Abstract
El tratamiento farmacológico de la totalidad de animales es una herramienta esencial en cualquier sistema modelo para estudios genéticos farmacológicos y químicos. Intravenosa (IV) de la inyección es a menudo la forma más eficaz y no invasiva de administración de un agente de interés. En el pez cebra (
Protocol
Parte 1. Preparación de material de inyección
- Tg (globina: GFP) células:
- Sangran los peces donante adulto con punta de la pipeta 10 ul recubiertos de heparina (1unit/ul) para los peces pinchazo detrás de enmalle.
- Aspirar las células rojas de la sangre y dispensar en tampón de células (0,9 x PBS + 5% de SFB + pluma 1% / estreptomicina).
- Suspensión de células de filtro sobre la malla 40uM y determinar la concentración de las células utilizando hemocitómetro como se describió previamente por LeBlanc et al.
- Centrifugar y resuspender en tampón de células a la concentración deseada de tal manera que el volumen de inyección final no es más que 5UL. Aquí se inyecta desde 1,5 hasta 2 millones células / receptor.
- Para el dextrano, Texas Red ®, disolver el colorante en DPBS para una concentración final de inyección de 10-12 mg / ml. Plan para inyectar 4 uL por pez.
Parte 2. Inyección
- Anestesiar a los peces en tricaína (4.2ml (4mg/ml) peces de agua tricaine/100ml).
- Lave la jeringa Hamilton 3-4 veces antes de la inyección con etanol al 70%. Enjuague 3-4 veces con DPBS 0.9x.
- Coloque el pescado lado dorsal hacia arriba y hacia la derecha en la esponja húmeda.
- Sostenga la jeringa Hamilton con su mano derecha y con su dedo índice en el émbolo. Suavemente estabilizar el cuerpo de los peces con la mano izquierda.
- Posición de la aguja con el bisel hacia arriba de tal manera que si el ojo del pez s fuera un reloj, la aguja se apunta a la posición de las 7:00 y en un ángulo de 45 grados a los peces (figura 1).
- Suavemente inserte la aguja 1-2 mm en la posición 07:00 y lentamente el émbolo.
- Permiten a los peces a recuperarse en el agua fresca E3.
- Lavado de la aguja, como se describió anteriormente, entre las inyecciones de diferentes reactivos.
- Flick solución celular para volver a suspender las células cada pocos minutos para evitar la formación de grumos de células.
- Mantener a los peces el flujo de una semana con cambios de agua diarios para evitar la infección. Seguimos pez en el agua en la UCI para este período (capa de 10 ml + 5 ml de estrés pemafix + melafix 5 ml por cada 38 litros de agua E3).
Parte 3. Resultados representante
Cuando se realiza correctamente, es posible visualizar material inyectado, si se le ha llamado de alguna manera. Por ejemplo, Tg (globina: GFP), las células rojas de la sangre debe ser visto bajo un microscopio de disección fluorescente que circulan en la vasculatura del receptor de pescado casper pronto después de la inyección, como se muestra en la figura 2. Del mismo modo, la inyección de un dextrano 70kDa, conjugado con Texas Red ® se puede visualizar en la vasculatura de los peces transparentes inmediatamente después de retro-orbital de la inyección (figura 3). Células fluorescentes de riñón de Tg (β-actina: GFP) de pescado de los donantes también se puede inyectar retro-orbital en peces irradiados receptor casper. Estas células eventualmente el hogar de la médula receptor (Figura 4) y puede luego ir a repoblar el riñón después de varias semanas (figura 4b).
Si la inyección es demasiado superficial o el ángulo de la aguja pasa por la cavidad venosa del seno retro-orbital, la sustancia inyectada se puede visualizar la puesta en común alrededor de los ojos o que sale de ella. Por otra parte, si la inyección es demasiado profundo, los peces pueden experimentar daños en los tejidos o el sangrado excesivo, aunque todavía se pueden recuperar. Cuando se realiza correctamente, la mortalidad después de retro-orbital inyección debe ser inferior al 5% del total de peces inyectados y el éxito de la entrega a la sangre debe ser mayor del 90% del total de peces inyectados.
Figura 1: Ilustración de la técnica de inyección retro-orbital. El ojo derecho de los peces se representa como un reloj analógico en el que la posición siete corresponde al lugar de la inyección correcta.
Figura 2: Tg (globina: GFP) los glóbulos rojos que circulan por los vasos de la cola de un pez adulto casper tres días después de retro-orbital de la inyección.
Figura 3: inyección de éxito de un dextrano 70kDa conjugados con Texas Red ® que se utiliza como colorante fluorescente produce vascularización de los peces adultos transparente, Casper y es fácil de ver con estándar de microscopía de fluorescencia todo animal.
Figura 4a: Tres días después de retro-orbital de la inyección de células de riñón de toda la médula de Tg (β-actina: GFP) de pescado de los donantes, las células pueden ser visualizados homing a la médula del riñón de los peces receptores irradiados adultos casper.
Figura4b: Cuatro semanas después de retro-orbital de la inyección de células de riñón de toda la médula de Tg (β-actina: GFP) de pescado de los donantes, la repoblación del riñón receptor con el verde de los donantes de médula todo las células del riñón se puede visualizar en los peces receptores irradiados adultos casper.
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Discussion
Retro-orbital de la inyección en adultos de pez cebra ofrece la más alta eficiencia de la entrega de material inyectado en el torrente sanguíneo con la menor incidencia de la mortalidad. Debido a la naturaleza del lugar de la inyección, la punción parece sanar rápidamente, disminuyendo la incidencia de la infección y la cantidad de sangre perdida. El sitio incluso pueden ser inyectados repetidamente durante un corto período de tiempo para las inyecciones diarias de medicamentos, por ejemplo.
Grandes cantidades de drogas debe ser adquirido por métodos tradicionales de tratamiento de peces adultos en el que los peces son simplemente sumergido y empapado en agua que contiene el fármaco de interés. Sin embargo, si el medicamento se inyecta directamente en el torrente sanguíneo del animal, una cantidad mucho más pequeña es necesaria para el tratamiento, disminuyendo así los costos de experimentación. Para ciertos compuestos que son demasiado grandes para entrar en la circulación de peces a través del remojo, en el caso de ciertos péptidos, retro-orbital de inyección también puede ser ventajoso.
Además, dado que la inyección RO es más rápido y más fácil que las técnicas de inyección intracardíaca en los peces adultos, otra aplicación de la inyección de RO pueden incluir la química genética para adultos. Por lo tanto, retro-orbital de la inyección puede facilitar enormemente la investigación de pez cebra que requieren la entrega químicos o químicos.
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Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes y una subvención del NIH para el estudio de la hematopoyesis embrionaria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
