Un système multi-paramétriques Islet périfusion dans un dispositif microfluidique périfusion

Summary

Un dispositif microfluidique périfusion îlot a été développé pour l'évaluation de la sécrétion d'insuline des îlots dynamiques multiples et simultanées imagerie de fluorescence de l'influx de calcium et mitochondrial changements potentiels.

Abstract

Un dispositif microfluidique périfusion îlot a été développé pour l'évaluation de la sécrétion d'insuline des îlots dynamiques multiples et simultanées imagerie de fluorescence de l'influx de calcium et mitochondrial changements potentiels. Le dispositif se compose de trois couches: la première couche contient un tableau de micro-puits (diamètre de 500 um et 150 um de profondeur) qui aident à immobiliser les îlots tandis exposés à des flux et d'optimiser la surface exposée des îlots; la seconde couche contient une circulaire périfusion chambre (3 mm de profondeur, 7 mm de diamètre), et la troisième couche contient un canal d'amenée de mélange que les fans avant injection dans la chambre périfusion (2 mm de largeur, 19 mm de longueur et de 500 um de hauteur) pour optimiser l'efficacité du mélange avant d'entrer dans la chambre périfusion. La création de gradients de glucose différents dont un linéaire, en forme de cloche, et des formes carrées peuvent également être créés dans le réseau périfusion microfluidique et est démontrée.

Protocol

A. microfabrication de 3-couche périphérique périfusion microfluidique

Fond du puits Maître Protocole (150 um puits profonds)

1. Nettoyez la galette en utilisant une lame de rasoir si nécessaire. Nettoyez avec de l'acétone, du méthanol, et de l'IAP. Effectuer le traitement au plasma à 50 Watts pendant 30 s.
2. Spin-100 SU8 @ 2000 rpm. [Etape 1: 500 min, 10 s, 100 rpm / s, étape 2: 2000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
   [NOTE: Ne placez pas la plaquette avec des pincettes après la filature SU8]
3. Cuire la galette molle à 65 ° C pendant 20 min et à 95 ° C pendant 50 min.
4. La plaquette est exposée à une lumière UV à travers un masque désiré. Dose pour 150 de hauteur est de 650 um mJ / cm ^2.
5. Post-exposition cuire la galette à 65 ° C pendant 1 min et à 95 ° C pendant 12 min.
6. Développer la galette dans SU8 développeur pendant 15 min.

Maître Microchannel Protocole (500 um puits profonds)

1. Nettoyez la galette en utilisant une lame de rasoir si nécessaire. Nettoyez avec de l'acétone, du méthanol, et de l'IAP. Effectuer le traitement au plasma à 50 Watts pendant 30 s.
2. Spin SU8-2150 @ 1000 tpm. [Etape 1: 500 min, 10 s, 100 rpm / s, étape 2: 1000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
3. Cuire la galette molle à 65 ° C pendant 15 min et à 95 ° C pendant 2 heures et 30 min.
4. La plaquette est exposée à une lumière UV à travers un masque désiré. La dose d'exposition pour les 650 um de hauteur est de 685 mJ / cm ^2.
5. Post-exposition cuire la galette à 65 ° C pendant 5 min et à 95 ° C pendant 35 min.
6. Développer la galette dans SU8 développeur pendant 20-30 min.

Préparation de la solution PDMS

1. Polydiméthylsiloxane (PDMS) solution est préparée en mélangeant soigneusement 10 parties d'élastomère de silicone avec 1 partie d'agent de durcissement d'un kit standard de Sylgard 184.
2. Les bulles générées dans la solution PDMS pendant le processus de mixage sont retirés en utilisant un dessiccateur à vide.
3. La bulle sans solution de PDMS est lentement distribué sur la SU8 maîtres et un plat vide de Pétri pour la troisième couche.
4. La température de la plaque chauffante est fixée à 75 ° C et le PDMS est guéri à cette température pendant 2 heures
5. Entrées, sorties et les puits de change sont perforées à l'aide du perforateur taille appropriée trou.
6. Les couches sont collées sur une lame de verre (taille de 0,1 mm) en utilisant un dispositif à plasma de poche.

B. Montage expérimental

1. Débit d'éthanol à 70% à travers le dispositif de micro-à stériliser. Débit de l'eau déminéralisée pour laver l'éthanol. Perfuser 50 ml de BSA à 0,5% grâce à l'appareil pour éviter l'adsorption non spécifique de l'insuline sur les parois de microcanaux.
2. La pente de la rampe de glucose et d'autres gradients connexes générées par le logiciel LabVIEW qui communique avec la seringue pompes sont testées pour s'assurer les gradients sont stables.
3. 25-30 îlots des souris ont été incubés avec 5 Fura-2/AM uM (un indicateur de calcium, Molecular Probes, CA) et de 2,5 uM rhodamine 123 (Rh123, un indicateur potentiel mitochondrial, Sigma, MO) pendant 30 min à 37 ° C dans tampon Krebs Ringer (KRB) contenant 2 mM de glucose
4. Les îlots des souris sont soigneusement pipette dans le dispositif microfluidique périfusion travers l'orifice d'entrée.
5. Le réseau microfluidique est alors l'installation en reliant l'entrée à l'aide de pompes à seringues tube Tygon et un connecteur en Y et la sortie de collecteur de fraction. L'appareil se trouve sur une étape de chauffage (37 ° C) sur le microscope et la tubulure d'entrée est chauffée sur une plaque chauffante pour maintenir la température de la chambre et une solution à 37 ° C.
6. Immédiatement après l'installation, les îlots des souris sont perifused avec KRB contenant 2 mM de glucose pendant 10 min puis une rampe de glucose (2mm 25mm) pendant 25 min.
7. Time-lapse images sont recueillies et analysées toutes les 15 s par le logiciel SimplePCI. Le perifusate est également collecté toutes les minutes en utilisant un collecteur de fraction d'analyser la sécrétion d'insuline en utilisant un kit ELISA.

Les résultats représentatifs

Îlots de souris ont été perifused avec un dégradé linéaire de 2-25 mM de glucose. Comme le montre la figure 1, l'influx de calcium et de la sécrétion d'insuline sont déclenchées après environ 13 minutes de périfusion, correspondant à 6 mM de glucose. Les changements dans le potentiel mitochondrial sont vus auparavant comme prévu, à environ 11 minutes. Ces données démontrent l'avantage d'utiliser ce réseau microfluidique afin de caractériser l'îlot physiologie.

Figure 1. Les réactions physiologiques à la stimulation des cellules des îlots.

Discussion

Les systèmes traditionnels de périfusion îlots de Langerhans (macroscopique et microscopique) ont quelques limitations, y compris complexes de configuration et de conception, de hautes exigences techniques, et la difficulté de créer l'utilisateur prescrits gradients chimiques dans le système. Le système microfluidique périfusion décrite ici surmonte ces limitations avec une géométrie simple de conception et de fabrication. Plus important encore, ce système peut être intégré à l'approche d'imagerie par fluorescence qui fournissent un outil unique pour étudier la physiologie des îlots. Le système a démontré avec des signaux haute-bruit et de la résolution spatio-temporelle de ces signaux de fluorescence. Le prototype actuel peut également organiser des configurations périfusion multiples en une seule puce et fournir différents types de micro-environnements à des fins d'application généralisée.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60ml Syringes	BD Biosciences
Fura-2 fluorescence dye	Molecular Probes, Life Technologies
Rhodamine123 Fluorescence dye	Molecular Probes, Life Technologies
Glucose	Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich
30" Silicone tubings	Cole-Parmer		1/16 x 1/8in
1.5ml Eppendorf tubes	Fisher Scientific
Y-connectors	Cole-Parmer		1/16” & 4mm
Syringe connectors	Cole-Parmer		female luer plug 1/16”
Straight connectors	Cole-Parmer		1/16”
Elbow connector	Cole-Parmer		1/16”
Havard syringe pump	Harvard Apparatus
Perifusion device
Hot plate	PMC
Thermometer	Omega Engineering, Inc.
Fraction collector	Gibson
Pippettor	Fisher Scientific
Inverted epiflorescence microscope	Olympus Corporation	IX71
Charge-coupled device	QImaging		Retiga-SRV, Fast 1394