Summary
Lensfree sur puce d'imagerie et de caractérisation des cellules est illustré. Cette approche sur-puce d'imagerie cellulaire fournit un outil compact et rentable pour le diagnostic médical et applications à haut débit biologie cellulaire, ce qui rend particulièrement adapté aux milieux pauvres en ressources.
Abstract
Microscopes optiques conventionnelles cellules d'image par l'utilisation de lentilles de l'objectif qui travaillent ensemble avec les autres lentilles et des composants optiques. Bien qu'assez efficace, cette approche classique a certaines limites de la miniaturisation de la plateforme d'imagerie pour le rendre compatible avec l'état avancé de l'art en microfluidique. Dans ce rapport, nous présentons les détails expérimentaux d'un concept d'imagerie sur puce sans lentille appelée LUCAS (
Protocol
Ici, nous discutons des procédures expérimentales qui sont impliqués dans LUCAS [1-3]. Pour illustrer la preuve de concept de LUCAS, nous allons décrire le processus d'imagerie pour un échantillon de sang total.
A. Mise en place d'imagerie
La plate-forme d'imagerie LUCAS présente des avantages significatifs pour fournir une alternative rentable et compacte pour les systèmes point-of-care cytométrie et instruments de diagnostic médical, notamment pour les ressources limitées. Plutôt que de détecter l'image des cellules, LUCAS capture au lieu d'hologrammes numériques des cellules qui sont créés par l'interférence de la lumière diffusée à partir de chaque cellule avec la lumière de fond. Un contrôle minutieux de la cohérence spatiale partielle de l'éclairage est essentiel pour permettre l'enregistrement holographique.
1. Réseau de capteurs numériques
La plateforme utilise un tableau LUCAS capteurs optoélectroniques à enregistrer numériquement des hologrammes cellule individuelle. À cette fin, chargé des dispositifs couple (CCD; Sample Models: KAI-11002, KAF-39000, de Kodak) ou Complementary metal-oxyde-semiconducteur puces (CMOS, modèle de l'échantillon: MT9P031, Micron) peuvent être utilisés. Les tailles des pixels pour les appareils Kodak chargée couple, KAI-11002, KAF-39000, et les capteurs d'image CMOS Micron sont 9 um, um 6,8 et 2,2 um, avec un actif FOV de 10 cm2, 18 cm2, et 24,4 mm2, respectivement. [1-2].
2. Source de lumière
Contrairement à la plupart des autres modalités d'imagerie microscopique, LUCAS n'a pas besoin d'un laser, et donc même une simple diode électroluminescente (DEL) peut être utilisé pour l'éclairage. Afin de permettre l'éclairage de longueur d'onde accordable, nous pouvons aussi utiliser un monochromateur avec une lampe au xénon (Cornerstone T260, Newport Corp) avec une fibre en silice fondue de qualité standard qui se compose d'un faisceau de fibres (77 564, Newport) et sténopé de ~ 100 pm de diamètre situé à ~ 5-10 cm au-dessus de la surface du capteur. Cette configuration longueur d'onde accordable l'éclairage fournit une plateforme flexible où les signatures holographique des cellules peut être ajusté, et les signatures numériques hybrides peuvent être synthétisés afin d'améliorer le rapport signal sur bruit pour une meilleure précision de la caractérisation et la spécificité. [3]
Préparation d'échantillons B. et imagerie
Une preuve de concept de LUCAS basée sur la puce d'imagerie sera démontrée en utilisant une solution hétérogène tel que décrit ci-dessous. Un protocole similaire pourrait être appliquée pour divers autres types de cellules [1-3].
1. Dilution de sang total et de préparation de la solution hétérogène
- Pour commencer le processus, d'obtenir un échantillon de sang total et les microbilles de polystyrène de différents diamètres (um 5, 10 et 20. Duke Scientific), et amener tous à température ambiante.
- Ajouter 2 mL de milieu RPMI 1640 liquides classiques (Fisher Scientific) comme diluant dans un tube en polypropylène stériles de 5 ml.
- Après une incubation de l'échantillon de sang total pendant 30 minutes, une pipette en hausse de 10 uL d'échantillon des érythrocytes sédimentés et le transférer dans la solution RPMI.
- Ajouter un volume total de 20 microbilles en polystyrène uL dans du RPMI de dilution des érythrocytes, et agiter la solution de cellules par pipetage douceur ou en utilisant un agitateur magnétique avec un agitateur.
- Placer un volume total de 5-15 uL solution hétérogène sur une lamelle et placer une seconde lamelle identique sur la solution en utilisant une pince. L'échantillon doit être pris en sandwich entre les deux lamelles uniformément.
- Puis, en utilisant un stylo vide (NT57-636, Edmund Optics) charge l'échantillon dans la région active du réseau de capteurs pour l'imagerie.
2. Coloration du sang total
- En commençant par la préparation d'un mélange de 0,1% tamponné éosine Y et une solution diluée de méthylène Nouveau en utilisant la puissance type pur éosine Y (MW = 691,85, Acros Organics), sans zinc pur Nouveau Bleu de Méthylène colorant (MW = 347,90, Acros Organics), et oxalate de potassium (ACS Réactif 99,0%, Acros Organics), chaque solution est purifiée avec une taille de pores 0,45 pm Syringless filtre (Whatman) pour coloration aqueuse de globules blancs.
- Ensuite, incorporer délicatement un réactif dissous coloration aqueuse à l'échantillon de sang total à un rapport de volume de 1:1 dans un bécher en polypropylène en utilisant un agitateur magnétique pendant 2 minutes et laisser incuber pendant 10 minutes.
- Transfert d'une solution tachés de sang de 50 uL dans un tube en polypropylène 5 ml et diluer avec du RPMI 1640 solution liquide classique (Fisher Scientific) de 1,95 mL d'acquérir un rapport de volume de 1:200. Puis, la dilution de vortex pendant 30 secondes. Un taux de dilution différents peuvent également être introduits à ce stade.
- Pipeter une solution cellulaire teinté de 10-100 uL entre les lamelles ou dans un réservoir microfluidique. Puis, en utilisant un stylo vide (NT57-636, Edmund Optics), placer l'échantillon sur la zone active de la matrice de capteurs.
Les résultats représentatifs
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Figure 1: LUCAS permet un comptage précis et la différenciation des cellules numériques diverses et les micro-objets en fonction de leurs signatures 2D holographique sans utiliser de lentilles, de lasers ou d'autres composants optiques encombrants. Caractéristique signatures LUCAS de divers micro-objets sont illustrés dans cette figure et sont comparées à une image au microscope classique obtenu avec un objectif 40X. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.
Figure 2: (gauche) Image brute d'un mélange hétérogène contenant des globules rouges, 10um, 5um et 3 particules um. (Droite) entièrement automatisée des résultats de caractérisation LUCAS pour le même champ de vue sont illustrés. Notez que l'algorithme de décision est robuste dans la caractérisation des régions à haute densité ainsi que des particules de faible rapport signal à bruit tel que les perles 3um.
Figure 3: L'interface personnalisée LUCAS est illustré. Basé sur Java LUCAS logiciel permet des entrées pour différentes conditions expérimentales telles que la taille des pixels du capteur ou de la longueur d'onde de la lumière. Sélection d'un champ de vue spécifique sur l'image peut également être faite et les modèles de cellules cibles peuvent être définies par l'utilisateur de construire une bibliothèque de cellules statistiques ombre. L'image acquise LUCAS peut alors être caractérisée basées sur ces données de formation (par exemple, la bibliothèque de cellules d'ombre) et la marque (comptés) l'image est affichée à l'utilisateur. Statistiques des résultats de comptage sont également stockés dans un fichier XML pour une analyse ultérieure.
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Discussion
Nous avons montré que la plate-forme LUCAS peut dénombrer et identifier précisément micro-objects/cells différentes sur une puce basée sur leurs signatures holographique, et fournit un outil prometteur pour le point-of-care diagnostic médical et à haut débit de biologie cellulaire. Afin de traiter avec exactitude les tendances enregistrées holographique, nous avons implémenté un logiciel personnalisé développé décision LUCAS. Cet algorithme, qui utilise une base de données de diffraction statistiques image créée par la formation d'images LUCAS, identifie différentes caractéristiques des cellules au sein d'une solution hétérogène; classifie le type et la position relative des cellules individuelles et compte le type de cellule désiré après l'application de seuillage à rejeter des particules indésirables / modèles cellulaires [1-3].
En résumé, la plate-forme LUCAS devrait fournir une solution rentable et compacte pour le point-of-care cytométrie et le diagnostic médical. Pour cette fin, LUCAS sera particulièrement utile pour le suivi des patients atteints du VIH dans les pays à ressources limitées ainsi que pour d'autres problèmes de santé mondiaux connexes tels que le paludisme et la tuberculose.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
