Summary
Lensfree על שבב הדמיה ואפיון של תאים מאויר. זה על שבב הדמיה הגישה לתא מספק כלי קומפקטי וחסכוני עבור אבחון רפואי תפוקה גבוהה ביולוגיה יישומים סלולריים, מה שהופך אותו מתאים במיוחד עבור הגדרות משאב עניים.
Abstract
קונבנציונלי מיקרוסקופים אופטיים תמונה תאים על ידי שימוש בעדשות מטרה שפועלים יחד עם עדשות אחרות רכיבים אופטיים. בעוד יעיל למדי, גישה זו הקלאסית יש מגבלות מסוימות המזעור של פלטפורמת הדמיה כדי לעשות את זה תואם המדינה המתקדמת של אמנות מיקרופלואידיקה. בדו"ח זה, אנחנו מציגים פרטים ניסיוני של מושג על שבב עצמים ללא עדשה הדמיה כינה לוקאס (
Protocol
כאן אנו דנים הפרוצדורות כי הם מעורבים לוקאס [1-3]. כדי להמחיש את הוכחת הרעיון של לוקאס נתאר את תהליך ההדמיה עבור כל דגימת דם.
א הדמיה הקמה
פלטפורמת הדמיה לוקאס מציגה יתרונות משמעותיים כדי לספק חלופה חסכונית קומפקטית cytometry נקודה של טיפול קיימים כלי אבחון רפואי, במיוחד עבור משאב מוגבל הגדרות. במקום לזהות את התמונה של התאים, לוקאס במקום לוכדת הולוגרמות דיגיטלית של התאים שנוצרים על ידי התערבות של האור מפוזר מתא אחד עם האור ברקע. בקרה קפדנית של קוהרנטיות מרחבית חלקית של הארה הוא קריטי כדי לאפשר הקלטה הולוגרפית.
1. חיישן דיגיטלי Array
הפלטפורמה לוקאס מנצל מערך חיישן אופטו דיגיטלית להקליט הולוגרמות תא יחיד. לענין זה, טעונה כמה מכשירים (CCD; מודלים לדוגמא: KAI-11002, 39000, כף, מן קודאק) או משלימים תחמוצת מתכת, שבבי מוליכים למחצה (CMOS, דגם קטע: MT9P031, מיקרון) ניתן להשתמש. גודל פיקסל של Kodak טעונה כמה מכשירים, KAI-11002, כף, 39000, ו מיקרון חיישני cmos image הם 9 מיקרומטר, 6.8 מיקרומטר ו 2.2 מיקרומטר, עם FOV פעיל של 10 CM2, 18 CM2 ו 24.4 mm2, בהתאמה. [1-2].
2. מקור האור
בניגוד לרוב שיטות הדמיה אחרות מיקרוסקופיים, לוקאס אינו מחייב לייזר ולכן גם פשוטה דיודה פולטת אור (LED) ניתן להשתמש בתאורה. על מנת לאפשר תאורה גל מתכונן, אנחנו יכולים גם לנצל monochromator עם מנורת קסנון (Cornerstone T260, ניופורט קורפ) יחד עם סיבי סיליקה תקן התמזגו כיתה המורכבת צרור של סיבים (77,564, ניופורט) ו חריר של ~ קוטר 100 מיקרומטר הממוקם ~ 50-10 ס"מ מעל פני החיישן. תצורה זו מתכונן תאורה גל מספק פלטפורמה גמישה שבה חתימות הולוגרפית של התאים יכול להיות מותאם, וחתימות דיגיטליות היברידית יכולה להיות מסונתז על מנת לשפר את יחס אות לרעש לדיוק אפיון טוב יותר וספציפיות. [3]
הכנת המדגם ב והדמיה
הוכחה של קונספט של לוקאס מבוסס על שבב הדמיה יהיה הפגינו באמצעות פתרון הטרוגנית כמתואר להלן. פרוטוקול דומה יכול להיות מיושם על מגוון סוגי תאים אחרים [1-3].
1. דם דילול מלא והכנת הפתרון הטרוגנית
- כדי להתחיל את התהליך, לקבל דגימת דם שלם microbeads פוליסטירן של בקטרים שונים (5, 10, ו - 20 מיקרומטר. דיוק מדעי), ולהביא את כל אותם לטמפרטורת החדר.
- הוסף 2 מ"ל של RPMI 1640 מדיה נוזל קלאסי (פישר סיינטיפיק) כמו diluent לתוך צינור פוליפרופילן סטרילי 5 מ"ל.
- לאחר דוגרים כל דגימת דם במשך 30 דקות, פיפטה עד 10 μL של הדגימה כדורית אדומה משקעים ולהעביר אותו לתוך התמיסה RPMI.
- הוספת נפח כולל של 20 microbeads פוליסטירן μL לתוך דילול RPMI כדורית אדומה, לבחוש את פתרון התא ידי בעדינות pipetting או באמצעות stirrer מגנטי עם בר ומערבבים.
- מניחים בנפח כולל של 5-15 פתרון הטרוגני μL על כיסוי להחליק במקום להחליק השני, לכסות זהה על פתרון באמצעות מלקחיים. המדגם צריך להיות דחוקה בין שתי החלקות לכסות באופן שווה.
- לאחר מכן, באמצעות עט ואקום (NT57-636, אדמונד אופטיקה) לטעון את המדגם על האזור הפעיל של המערך חיישן הדמיה.
2. דם מלא מכתים
- החל הכנת תערובת של 0.1% שנאגרו Eosin Y ו מתילן בדילול הפתרון החדש באמצעות סוג כוח טהור Eosin Y (MW = 691.85, אורגניקס acros), אבץ חופשי טהור ניו מתילן בלו צבען (MW = 347.90, אורגניקס acros), ו מונוהידראט Oxalate אשלגן (ACS מגיב 99.0%, אורגניקס acros); כל פתרון הוא מטוהרים עם גודל נקבוביות 0.45 מיקרומטר סינון Syringless (Whatman) עבור מימית מכתים כדוריות דם לבנות.
- ואז, ומערבבים בעדינות מגיב מומס מכתים מימית עם דגימת הדם כולו ביחס נפח של 1:1 בכוס פוליפרופילן באמצעות stirrer מגנטי למשך 2 דקות ו דגירה במשך 10 דקות.
- העברת פתרון מוכתמת בדם של 50 μL לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל ו לדלל עם פתרון 1640 RPMI נוזלי קלאסי (פישר סיינטיפיק) של 1.95 מ"ל לרכוש יחס נפח של 1:200. ואז, המערבולת דילול למשך 30 שניות. שיעור הדילול שונה יכול להיות גם הציג בשלב זה.
- פיפטה פתרון תא מוכתם של μL 10-100 בין תלושי לכסות או בתוך מאגר microfluidic. לאחר מכן, באמצעות עט ואקום (NT57-636, אדמונד אופטיקה), במקום את הדגימה על האזור הפעיל של מערך החיישנים.
נציג תוצאות
ve_content ">
איור 1: לוקאס מאפשרת ספירה מדויקת בידול דיגיטלי של תאים שונים מיקרו אובייקטים המבוססים על חתימות הולוגרפית 2D שלהם ללא שימוש בעדשות, לייזרים או רכיבים אופטיים מגושם. אופיינית חתימות לוקאס מיקרו חפצים שונים באים לידי ביטוי דמות זו מושווים מול תמונת מיקרוסקופ קונבנציונאלי שהושג עם עדשה אובייקטיבי 40X. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
איור 2: (משמאל) תמונה גלם תערובת הטרוגנית המכילה כדוריות דם אדומות, 10um, 5um ו 3 חלקיקים אממ. (ימין) לגמרי אוטומטיות תוצאות לוקאס אפיון עבור אותו שדה הראייה מומחשים. שים לב כי אלגוריתם ההחלטה היא איתנה באפיון אזורי צפיפות גבוהה וכן חלקיקים עם האות נמוכה יחס רעש כמו חרוזים 3um.
איור 3: ממשק מותאם אישית לוקאס מאויר. תוכנה מבוססת Java לוקאס מאפשר תשומות עבור תנאים ניסויים שונים כגון גודל החיישן פיקסל או אורך הגל של האור. בחירת תחום מסוים של מבט על התמונה יכול להיות גם והתא דפוסי היעד יכול להיות מוגדר על ידי המשתמש לבנות ספריה סטטיסטי צל התא. התמונה נרכשה לוקאס אז יכול להיות מאופיין על בסיס נתונים אלה הכשרה (כלומר, ספריה צל התא) לבין המסומן (ספרתי) התמונה מוצגת למשתמש. סטטיסטיקה של תוצאות ספירת מאוחסנים גם כקובץ XML לניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו מאויר כי פלטפורמת לוקאס יכול לספור במדויק ולזהות micro-objects/cells שונים על שבב המבוסס על חתימות הולוגרפית שלהם, מספק כלי מבטיח עבור נקודה של טיפול אבחון רפואי תפוקה גבוהה התא בביולוגיה. כדי התהליך במדויק את דפוסי הולוגרפית מוקלט, יישמנו תוכנה אישית שפותחה לוקאס ההחלטה. זה אלגוריתם, אשר משתמשת עקיפה סטטיסטי התמונה באתר נוצר על ידי הכשרה של תמונות לוקאס, מזהה מאפיינים שונים של תאים בתוך תמיסה הטרוגנית; מסווג את סוג ואת המיקום היחסי של תאים בודדים וסופר את סוג התא הרצוי לאחר החלת thresholding לבטל החלקיקים לא רצויות / דפוסי תא [1-3].
לסיכום, פלטפורמה לוקאס אמור לספק פתרון חסכוני וקומפקטי עבור cytometry נקודה של טיפול ואבחון רפואי. לשם כך, לוקאס יהיה בעיקר להיות שימושי עבור ניטור של חולי איידס הגדרות משאב מוגבל, כמו גם עבור אחרים בעיות בריאות הקשורות העולמי כגון מלריה ושחפת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
