Summary
細胞のLensfreeオンチップのイメージングと特性が示されている。このオンチップ細胞イメージングのアプローチは、リソースの乏しい環境のために特に適し、医療診断およびハイスループット細胞生物学のアプリケーション向けのコンパクトで費用効果の高いツールを提供します。
Abstract
他のレンズと光学部品と一緒に動作する対物レンズの使用により、従来の光学顕微鏡画像の細胞。非常に効果的ですが、この古典的なアプローチは、マイクロフルイディクスの技術の高度な状態と互換性を持たせるためにイメージングプラットフォームの小型化に一定の制限があります。このレポートでは、我々はLUCASと呼ばlenslessオンチップイメージングコンセプトの実験の詳細を紹介する（
Protocol
ここでは、LUCAS [1-3]に関与している実験的な手順を説明します。 LUCASの概念実証を説明するために我々は、全血サンプルのイメージングプロセスを説明します。
A.イメージングセットアップ
LUCASイメージングプラットフォームは、特に資源が限られた設定のために、既存のポイントオブケアサイトメトリーや医療診断ツールに費用対効果の高い、コンパクトな代替手段を提供するために重要な利点を示す。むしろ細胞の画像を検出するよりも、LUCASは、代わりに背景光との各セルからの散乱光の干渉によって作成されているセルのデジタルホログラムをキャプチャします。照明の部分的な空間的コヒーレンスの注意深い制御は、ホログラフィック記録を有効にするために重要です。
1。デジタルセンサーアレイ
LUCASプラットフォームは、デジタル、個々のセルのホログラムを記録する光センサアレイを利用しています。使用することができます：または相補型金属酸化膜半導体チップ（MT9P031、マイクロンCMOS、サンプルモデル）：、この目的のために、いくつかのデバイスを（KAI - 11002、KAF - 39000、コダックからのサンプルモデルCCD）にてご利用いただけます。それぞれ、アクティブな10平方センチメートルのFOV、18平方センチメートル、および24.4平方ミリメートルで、コダックのためのピクセルサイズはいくつかのデバイス、KAI - 11002、KAF - 39000を充電し、マイクロンCMOSイメージセンサーは9μm、6.8μmおよび2.2μmです。 [1-2]。
2。ライトソース
他のほとんどの顕微鏡イメージングのモダリティとは異なり、LUCASは、レーザーを必要としないため、さらに簡単な発光ダイオード（LED）は照明用に使用することができます。波長可変光源を有効にするために、我々はまた、繊維の束（77564、ニューポート）とのピンホールで構成される標準グレードフューズドシリカ繊維と一緒にキセノンランプ（コーナーストーンT260、ニューポート社）とモノクロメータを利用することができます〜直径100μm、センサ表面上に5〜10 cmの位置。この波長可変光源の構成は、細胞のホログラフィック署名が調整できる柔軟なプラットフォームを提供し、ハイブリッドデジタル署名は、優れた特性評価の精度と特異性のために信号対雑音比を向上させるために合成することができる。 [3]
B.サンプルの調製とイメージング
イメージングチップに基づいて、LUCASの概念実証は、下記のように不均一溶液を用いて実証される。同様のプロトコルは、様々な他の細胞タイプ[1-3]に適用することができる。
1。全血の希釈と不均一溶液の準備
- プロセスを開始するには、全血サンプルと様々な直径（5、10、20μmである。デュークサイエンティフィック）のポリスチレンビーズを取得し、室温にそれらのすべてをもたらす。
- 滅菌5mLのポリプロピレンチューブに、希釈剤としてRPMI 1640古典的な液体培地（フィッシャーサイエンティフィック社）の2 mlを加え。
- 30分間の全血サンプルをインキュベートした後、沈降した赤血球試料の10μLをピペットおよびRPMI溶液中にそれを転送する。
- 赤血球RPMIの希釈に20μLポリスチレンのマイクロビーズの合計量を追加し、穏やかにピペッティングしたり、攪拌棒でマグネチックスターラーを使用して、細胞溶液を攪拌。
- カバースリップの上に5から15μL不均一溶液の総量を配置し、鉗子を使用して、ソリューション秒以上、同一のカバースリップを配置。サンプルは均等に2つのカバースリップの間に挟まれるべきである。
- その後、真空ペン（NT57 - 636、エドモンドオプティクス）を使用すると、イメージングのためのセンサアレイの活性領域にサンプルをロードします。
2。全血の染色
- 0.1％の混合物の製造から始めては電力型の純粋なエオシンY（MW = 691.85、アクロスオーガニック）、亜鉛を含まない純粋な新規メチレンブルー色素（MW = 347.90、アクロスオーガニック）を使用して、エオシンYおよび希薄化後のニューメチレンブルー溶液をバッファとシュウ酸カリウム一水和物（99.0％試薬ACS、アクロスオーガニック）、各溶液は、水性白血球の染色のための0.45μmの孔径Syringlessフィルター（ワットマン）で精製される。
- その後、静かに2分間マグネチックスターラーを使用することによりポリプロピレンのビーカーで1:1の体積比で全血検体を溶解した水溶液染色試薬を攪拌し、10分間インキュベートする。
- 5mLのポリプロピレンチューブに50μLのステンド血液を移し、1:200の体積比を取得するために1.95 mLのRPMI 1640古典的な溶液（フィッシャーサイエンティフィック）で希釈する。その後、渦30秒のための希釈。異なる希釈率も、この段階で導入することができる。
- カバーガラスの間やマイクロ流体貯留層内で10〜100μLの染色細胞液をピペットで。その後、真空ペン（NT57 - 636、エドモンドオプティクス）を使用して、センサアレイの活性領域の上に試料を配置。
駐在結果
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図1：LUCASはどんなレンズ、レーザーや他の大型の光学部品を使用せずに正確なカウントと様々な細胞とその2次元ホログラフィック署名に基づくマイクロオブジェクトのデジタル分化を可能にする。様々なマイクロオブジェクトの特性LUCAS署名は、この図に示されていると40倍対物レンズで得られた従来の顕微鏡画像と比較されます。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。
図2：赤血球、10um、5um、3 UM粒子を含む不均一な混合物の（左）RAW画像。ビューの同じフィールド（右）全自動LUCASの特性評価の結果が示されている。意思決定のアルゴリズムは3umビーズのような雑音比が低い信号で高密度領域だけでなく、粒子の特性に堅牢であることに注意してください。
図3：LUCASカスタムのインターフェースが示されている。 JavaベースのLUCASソフトウェアは、センサの画素サイズや光の波長など、さまざまな実験条件の入力が可能になります。 image上のビューの特定のフィールドの選択を行うこともできるし、標的細胞のパターンは統計的な細胞の影のライブラリを構築するためにユーザが定義することができます。取得したルーカスのイメージは、この訓練データに基づいて特徴づけることができる（すなわち、セルの影のライブラリ）とマーク（カウント）のイメージがユーザーに表示されます。カウント結果の統計情報も、さらなる分析のためのXMLファイルとして保存されます。
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Discussion
我々は、LUCASプラットフォームが正確にカウントし、そのホログラフィック署名に基づくチップ上に様々なmicro-objects/cellsを識別できるよう図示、およびポイントオブケア医療診断およびハイスループット細胞生物学のための有望なツールを提供している。正確に記録されたホログラムパターンを処理するために、我々は独自に開発したLUCASの意思決定のソフトウェアを実装。ルーカスの画像の訓練によって作成された統計的回折像のデータベースを使用してこのアルゴリズムは、不均一溶液内の細胞の様々な機能を識別し、タイプや個々の細胞の相対的な位置を分類し、不要な粒子を破棄するように閾値処理を適用した後、所望の細胞タイプをカウント/セルのパターン[1-3]。
要約すると、LUCASのプラットフォームでは、ポイントオブケアサイトメトリーや医療診断のためのコスト効率が高くコンパクトなソリューションを提供する必要があります。この最後の場合は、LUCASは、特にリソースが限られた環境でだけでなく、マラリアや結核などの他の地球規模の健康関連の問題のためのHIV患者のモニタリングに有効となります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
