Summary
Внешнее электрическое поле индуцирует напряжение на мембране клетки, называемые наведенного напряжения мембраны (ΔΦ). С помощью потенциометрического красителя ди-8-ANEPPS, можно измерить ΔΦ неинвазивно. Это видео показывает протокол для измерения ΔΦ использованием ди-8-ANEPPS.
Abstract
Размещение клетки в внешнее электрическое поле вызывает перераспределение внутри местных заряд и вне клетки в непосредственной близости от клеточной мембраны, в результате чего напряжение на мембране. Это напряжение, называемое наведенное напряжение мембраны (также индуцированные трансмембранные напряжения, или индуцированных разница трансмембранного потенциала) и обозначается ΔΦ, существует только до тех пор, как внешнее поле присутствует. Если покоя напряжение присутствует на мембране, наведенного напряжения накладывает (добавляет) на него. Используя один из потенциометрического флуоресцентные красители, такие как ди-8-ANEPPS, можно наблюдать изменения ΔΦ на клеточной мембране и измерить его значение неинвазивно. ди-8-ANEPPS становится сильно люминесцентные при привязке к липидный бислой клеточной мембраны, с изменением интенсивности флуоресценции пропорциональна изменению ΔΦ. Это видео показывает протокол для измерения ΔΦ использованием ди-8-ANEPPS, а также демонстрирует влияние формы клеток от амплитуды и пространственного распределения ΔΦ.
Protocol
Часть I: Предварительные шаги
- В этом эксперименте яичника китайского хомячка линии клеток (СНО-К1) используется. Клетки высевают в Lab-Tek II камеры (2 скважины, 4 см 2 каждый) (Nalge Nunc, Германия) при ~ 0.7x10 5 клеток / мл в HAM-F12 культуральной среде дополнен с 8% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,15 мг / мл L-глутамина, 16 мг / мл гентамицина (все от Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия), и 200 ед / мл Crystacillin (Плива, Загреб, Хорватия), и инкубировали в 5% CO 2 при температуре 37 ° C. Кроме того, клетки могут быть также высевают на # 1 стеклянная крышка скользит (0,13 до 0,16 мм), с покрытием сотовой клея, например полилизином.
- Инкубируйте клетки в питательной среде. Инкубационный продолжительностью 2 до 4 часов дает клеткам, которые все еще примерно сферическую, но прочно прикреплены к поверхности с небольшой частью их мембраны. Кроме того, после 16 до 20 часов инкубации клетки полностью прикреплен к поверхности и более сложные формы, но большинство из них до сих пор не делиться.
- Подготовка маточного раствора 10 мМ ди-8-ANEPPS (Invitrogen, Юджин, штат Орегон, США) путем добавления 843 мкл ДМСО (Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия) до 5 мг красителя в оригинальном флаконе Invitrogen. Маточный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Перед началом экспериментов, разогреть решение пока кристаллы ДМСО растворяются.
- Некоторые клеточные линии могут потребовать использования плуроник, чтобы облегчить красителя включения в клеточные мембраны. Pluronic можно приобрести в 20% маточного раствора в ДМСО (F-127, Invitrogen, Юджин, штат Орегон, США), или маточный раствор той же концентрации могут быть получены путем растворения плуроник в ДМСО. Исходный раствор плуроник можно хранить при комнатной температуре.
Часть II: Загрузка клеток с ди-8-ANEPPS
- Смешайте 3 мкл 10 мМ ди-8-ANEPPS и 2,5 мкл 20% плуроник в 1 мл модификации Spinner (кальций обедненный вариант) от минимально необходимого SMEM Medium (средний M8167 или M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия ) в 1,5 мл трубки Эппендорф. Это дает "загрузки решение", содержащий около 30 мкМ ди-8-ANEPPS и 0,05% от плуроник. Для других типов клеток, их родной культуре средств массовой информации может быть использован вместо SMEM.
- Замените питательной среде в лаборатории-Tek камера с загрузкой решение. Передача камере холодильника в течение 10 мин при 4 ° C. При этой температуре интернализации красителя через мембрану плазмы в значительной степени подавляется.
- После окрашивания, аккуратно вымыть избыток красителя два-три раза с чистой SMEM.
- Оставьте 1,5 мл SMEM в камере.
Часть III: эксперимент и получение изображений
- Клетки, наблюдаемые с помощью флуоресцентного микроскопа (в нашем случае Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Германия), оснащенных цель нефти погружения (x63, Н. А. 1.4), монохроматор (полихромные IV, Visitron, Германия) и охлаждением ПЗС-камеры (VisiCam 1280, Visitron, Германия). Изображения, полученные с MetaFluor 7.1.1 и обрабатываться в Метаморф 7.1.1 (как Molecular Devices, Downingtown, Пенсильвания, США), но другие подобные приобретение программного обеспечения также может быть использован. Установить длины волны возбуждения в приобретение программного обеспечения до 490 нм и выбрать подходящий фильтр выбросов ANEPPS, например, полосовой фильтр с центром в нм 605 (605/55m, дихроичных 565 DCXR, Chroma, Рокингем, VT, США). Если монохроматора отсутствует, возбуждение фильтр с центром в точке 490 нм может быть использован вместо.
- Место камере с клетками на столике микроскопа, положение электродов в нижней части камеры и подключить их к импульсным генератором. Среда должна покрывать электроды.
- Для поддержания жизнеспособности клеток и снижению отопления, импульс должен быть достаточно низкой амплитудой и короткой продолжительности. В этом эксперименте прямоугольный импульс с амплитудой 35 В и 50 мс (достаточно низко, чтобы избежать электропорации) генерируется с использованием источника постоянного напряжения и на заказ с микропроцессорным управлением переключатели устройства. Кроме того, коммерческие генератора импульсов, например, 33210A (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США), подключенные к усилителю или коммерческих стимулятор, таких как S88 (Grass, West Warwick, RI, США), могут быть использованы. Импульс поступает на два параллельных Pt / Ir электродов проволоки с диаметром 0,8 мм и 4 мм расстояние между ними, создавая электрическое поле около 88 В / см между электродами и вызывающие ΔΦ. Точное распределение поля между электродами, используемые в настоящем эксперимент описан в [1].
- Найти клетки интерес. Применение одного электрического импульса или последовательности импульсов. Для каждого импульса, приобрести две флуоресцентные изображения: один непосредственно перед импульсом (контроль изображения), и один во время импульса (импульса изображения). Из-за низкой реакции ди-8-ANEPPS, изменения в флуоресценции трудно различить невооруженным глазом, и стало очевидно, ONLу после обработки. Импульса доставки должны быть синхронизированы с захвата изображения, которая является особенностью приобретения программного обеспечения. Чтобы избежать фотообесцвечивания и возможные отопления, освещения может быть ограничена продолжительность импульса.
Часть IV: обработки и анализа изображений
- Открытые изображения в программном обеспечении Метаморф. Для каждого импульса, вычитание фона в обоих контроля и импульса изображения.
- Выбрать ячейку и установить область интереса, так что он соответствует мембраны. Мера интенсивности флуоресценции по этому региону в образе управления и импульса и передачи значений в таблицу.
- Для каждого импульса, вычесть контроль данных из импульсов данных, а полученный результат разделить на контроль данных для получения относительной флуоресценции изменения. Если последовательность импульсов применяется, значения относительных изменений флуоресценции определяется для каждого импульса может быть усреднены, чтобы получить более надежные измерения.
- Преобразование относительной флуоресценции изменений в ΔΦ использованием калибровочной кривой. Приблизительную оценку этой кривой может быть получено из литературы, но и для более высокой точностью, он должен быть измерен для каждой конкретной установки. Для клеток и установки, используемые в настоящем эксперименте 6%-ное снижение флуоресценции соответствует 100 мВ увеличение ΔΦ [2].
- Наконец, участок напряжения в зависимости от относительной длины дуги в графический пакет программного обеспечения, таких как Excel (Microsoft Corp, Редмонд, штат Вашингтон, США), Sigma Участок (Systat Software Inc, Сан-Хосе, Калифорния, США), или Происхождение (OriginLab Corp, Нортхемптон, Массачусетс, США). Кривая может быть сглажены с помощью подходящего фильтра, таких, как движущиеся фильтр среднего.
Discussion
Измерения индуцированного мембраны (трансмембранный) напряжение, ΔΦ, может иметь важное значение в различных экспериментальных условиях, таких как исследования напряжения закрытого мембранных каналов, распространения потенциала действия, сердечной стимуляции клетки или клеточные мембраны электропорации [3, 4, 5, 6 , 7]. С помощью простой формы клетки, ΔΦ может быть вычислена аналитически. Например, для сферической клетки, ΔΦ задается уравнением с Шван, которая гласит, что напряжение пропорционально напряженности поля и размера ячейки и следует косинус вдоль мембраны [8, 9]. Для более сложных форм клетки, ΔΦ может значительно отклоняться от косинус и должен быть определен либо численно, с помощью компьютера [2, 10, 11], или экспериментально, с помощью потенциометрического красителя [12, 13, 14, 15].
Один из потенциометрического красители широко используются для этой цели является ди-8-ANEPPS (ди-8-бутил-амино-нафтил-этилен-пиридиния-пропил-сульфонат), быстро красителя с возбуждения и спектры излучения зависит от мембранного напряжения, , которая позволяет неинвазивным наблюдений вариаций ΔΦ на клеточной мембране и измерить его значение. В этом видео мы покажем, экспериментальный подход для определения ΔΦ с помощью ди-8-ANEPPS.
Краситель был разработан профессором Лесли Лева и его коллеги [13, 14] в Университете Коннектикута и принадлежит к классу быстродействующих красителей. ди-8-ANEPPS является nonfluorescent в воде и становится сильно люминесцентные, когда она включает в липидный бислой клеточной мембраны. Изменения ΔΦ результатов в изменении внутримолекулярного распределения заряда и соответствующие изменения в спектральных профиль и интенсивность флуоресценции красителя в. Интенсивности флуоресценции ди-8-ANEPPS меняется пропорционально изменению ΔΦ; реакция красителя является линейной для напряжений в диапазоне от -280 мВ до +250 мВ [4, 16]. Относительно небольшие изменения флуоресценции красителя, неравномерное окрашивание мембраны, и красителя интернализации делают ди-8-ANEPPS менее пригоден для абсолютных измерений мембранного напряжения, например, его покоя компонентом, хотя такие усилия были также зарегистрированы [17]. Это, однако, подходит для измерения больших изменений в мембранных напряжений, таких как возникновение наведенного напряжения мембраны в nonexcitable клетки воздействию внешних электрических полей [12, 13], или потенциалы действия в возбудимых клеток [4, 5]. Хотя здесь не применяется, ди-8-ANEPPS также позволяет определить ΔΦ по логометрических измерения возбуждения флуоресценции [18] или излучения [19], что увеличивает чувствительность и снижает ответ вышеуказанных эффектов. Как ди-8-ANEPPS пятен мембраны, она также может быть использован ясно, как мембранный маркер [2].
Один из недостатков красителя том, что он склонен к фотообесцвечивания, так, что длительное воздействие сильного света следует избегать. Калибровка красителя производится либо с (я) калия валиномицина ионофором и набор различных концентрации калия во внешней среде [2,18], или (II), патч-зажим в режиме напряжения зажим [17].
Наконец, при измерениях ΔΦ на сферические клетки и клетки, более сложных форм, видео демонстрирует влияние формы клеток от амплитуды и пространственного распределения ΔΦ. Таким образом, для сферических клеток ΔΦ близка к косинус, в согласии с уравнением Шван, в то время как для более сложных форм ячейки пространственного распределения ΔΦ более сложной [20] ...
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Словенский исследовательского агентства с проектом Z2-9229 и программу Р2-0249. Это видео представляет дополнительный материал для "Электропорация основе технологий и методов лечения" научно-практический семинар и аспирантуре, организованной два раза в год на факультете электротехники в университете Любляны, Словения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery. J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).
- Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells. Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).
- Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential. Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).
- Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. Distinct electric potentials in soma and neurite membranes. Neuron. 13, 1187-1193 (1994).
- Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells. Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).
- Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. Electropermeabilization of cell membranes. Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).
- Sersa, G., Miklavčič, D. Electrochemotherapy of tumours. JoVE. 22, (2008).
- Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis. Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).
- Schwan, H. P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).
- Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. An approach to electrical modeling of single and multiple cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).
- Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation. IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).
- Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields. Biophys. J. 50, 339-348 (1986).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).
- Loew, L. M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields. Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).
- Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys. J. 59, 209-220 (1991).
- Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields. Biophys. J. 56, 121-128 (1989).
- Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons. Biophys. J. 74, 48-53 (1998).
- Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential. Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).
- Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).
- Pucihar, G., Miklavčič, D. A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells. IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).
