Summary
ووصف الجهد المستحث غشاء (ΔΦ) الخارجية الحقل الكهربائي يؤدي الى الجهد على غشاء الخلية. باستخدام الصبغة potentiometric دي - 8 - ANEPPS ، فمن الممكن لقياس ΔΦ noninvasively. هذا الفيديو يبين بروتوكول لقياس ΔΦ باستخدام دي - 8 - ANEPPS.
Abstract
وضع خلية في حقل كهربائي خارجي يؤدي إلى إعادة توزيع تهمة المحلية داخل وخارج الخلية في المنطقة المجاورة لغشاء الخلية ، مما أدى إلى الجهد عبر الغشاء. هذا الجهد ، ويسمى الغشاء الجهد المستحث (أيضا بفعل الجهد عبر الغشاء ، أو بفعل فرق الجهد عبر الغشاء) ويرمز لها ب ΔΦ ، موجود فقط طالما الحقل الخارجي موجودا. إذا كان الجهد يستريح موجودة على الغشاء ، والجهد المستحث تطغى (يضيف) على ذلك. باستخدام واحدة من الأصباغ الفلورية في potentiometric ، مثل ثنائي ANEPPS - 8 ، فمن الممكن لمراقبة التغيرات في ΔΦ على غشاء الخلية وقياس قيمتها noninvasively. دي - 8 - ANEPPS بقوة عندما يصبح الفلورسنت منضمة إلى طبقة ثنائية المادة الدهنية في غشاء الخلية ، مع تغير كثافة مضان يتناسب مع تغيير ΔΦ. هذا الفيديو يبين بروتوكول لقياس ΔΦ باستخدام دي - 8 - ANEPPS وكما يوضح تأثير شكل الخلية على السعة والتوزيع المكاني للΔΦ.
Protocol
الجزء الأول : الخطوات الأولية
- في هذه التجربة تم استخدام خلية مبيض الهامستر الصيني الخط (CHO - K1). والخلايا في غرف مطلية الثاني مختبر تيك (2 الآبار ، 4 سم 2 لكل منهما) (Nalge نونك وألمانيا) في الخلايا ~ 0.7x10 5 / مل في HAM - F12 مستنبت تستكمل مع 8 ٪ مصل العجل الجنين ، 0.15 ملغ / مل L - الجلوتامين ، 16 ملغ / مل جنتاميسين (جميع من سيغما الدريخ ، Steinheim ، ألمانيا) ، والوحدات 200 / مل Crystacillin (شركة بليفا ، زغرب ، كرواتيا) ، وحضنت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن تكون مطلية على الخلايا # 1 ينزلق الغطاء الزجاجي (0،13-0،16 مم) ، المغلفة مع مادة لاصقة مثل متعدد الليزين الخلوية.
- احتضان الخلايا في المتوسط ثقافتهم. حضانة دائم 2 إلى 4 ساعات غلة الخلايا التي لا تزال كروية تقريبا ، ولكن يرتبط بقوة إلى السطح مع جزء صغير من الغشاء بهم. بدلا من ذلك ، بعد 16 إلى 20 ساعة من الحضانة ، وترد بشكل كامل على سطح الخلايا ولها أشكال أكثر تعقيدا ، ولكن معظمها لا يزال غير تقسيم.
- إعداد المخزون 10 مم حل ثنائي ANEPPS - 8 (Invitrogen ، يوجين ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية) وذلك بإضافة 843 ميكرولتر من DMSO (سيغما الدريخ ، Steinheim وألمانيا) إلى 5 ملغ من الصبغة في القارورة Invitrogen الأصلي. التي يمكن تخزينها في حل الأسهم في الثلاجة في درجة مئوية 4 لأشهر عدة. قبل البدء في التجارب ، والاحماء الحل حتى تذوب بلورات DMSO.
- قد تكون بعض خطوط الخلايا تتطلب استخدام pluronic لتخفيف الصبغة التأسيس في غشاء الخلية. ويمكن شراء الأسهم Pluronic في حل 20 ٪ في DMSO (F - 127 ، Invitrogen ، يوجين ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، أو محلول المخزون من نفس التركيز ويمكن حل أعدتها pluronic في DMSO. ويمكن تخزين محلول المخزون من pluronic في درجة حرارة الغرفة.
الجزء الثاني : تحميل الخلايا مع ثنائي ANEPPS - 8
- مزيج 3 ميكرولتر من 10 ملي دي - 8 - ANEPPS و 2.5 ميكرولتر من pluronic 20 ٪ في 1 مل من التعديل سبينر (الكالسيوم المنضب الإصدار) من SMEM متوسطة الأساسية الدنيا (المتوسطة أو M8167 M4767 ، سيغما الدريخ ، Steinheim ، ألمانيا ) في أنبوب 1.5 مل إيبندورف. هذه الغلة "حل تحميل" التي تحتوي على ما يقرب من 30 ميكرومتر دي - 8 - ANEPPS و 0.05 ٪ من pluronic. لأنواع الخلايا الأخرى ، يمكن استخدام وسائل الاعلام ثقافتهم الأصلية بدلا من SMEM.
- استبدال الثقافة المتوسطة ، في قاعة مختبر تيك مع الحل التحميل. نقل إلى غرفة الثلاجة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. عند هذه الدرجة ، إلى حد كبير هو استيعاب للصباغة من خلال غشاء البلازما الكبت.
- بعد التلوين ، وغسل بلطف الصبغة مرتين إلى ثلاث مرات مع SMEM النقي.
- ترك 1.5 مل من SMEM في الغرفة.
الجزء الثالث : التجربة والحصول على الصور
- ويلاحظ في الخلايا باستخدام المجهر مضان (في حالة لدينا زايس AxioVert 200 ، زايس ، وألمانيا) أن تكون مجهزة للنفط الهدف الغمر (x63 ، NA 1.4) ، وهو VisiCam مستوحد اللون (فازة الرابع ، Visitron ، ألمانيا) ، واتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا تبريد ( 1280 ، Visitron ، ألمانيا). يتم الحصول على الصور مع MetaFluor 7.1.1 ومعالجتها في MetaMorph 7.1.1 (كل الأجهزة الجزيئية ، Downingtown ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ولكن يمكن أيضا استخدام برامج أخرى مشابهة يمكن اكتساب. تعيين الطول الموجي الإثارة في البرنامج إلى 490 نانومتر اقتناء واختيار مرشح مناسب لANEPPS الانبعاثات ، على سبيل المثال ، مرشح تمرير النطاق تركزت في نانومتر 605 (605/55m ، 565 DCXR مزدوج اللون ، كروما ، روكينجهام ، VT ، الولايات المتحدة). إذا مستوحد اللون غير متوفر ، ويمكن استخدام عامل تصفية الإثارة تركزت في 490 نانومتر بدلا من ذلك.
- مكان الغرفة مع الخلايا على خشبة المسرح المجهر ، موقف الأقطاب في الجزء السفلي من الغرفة وربطها مولد النبض. ينبغي أن متوسط تغطية الأقطاب.
- للحفاظ على سلامة الخلية والحد من التدفئة ، وينبغي أن يكون من نبض السعة منخفضة بما فيه الكفاية ومدتها قصيرة. في هذه التجربة يتم إنشاء مربع مع نبض V سعة 35 و 50 مللي ثانية مدتها (منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب electroporation) باستخدام امدادات التيار الكهربائي العاصمة ، وصنعت خصيصا جهاز التحويل والمعالجات التي تسيطر عليها. بدلا من ذلك ، مولد النبض التجارية ، مثل 33210A (اجيلنت ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) متصلة مكبر للصوت أو منشط التجارية ، مثل S88 (العشب ، وست وارويك ، ري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ويمكن استخدامها. يتم تسليم نبض لاثنين من أقطاب متوازية سلك حزب العمال / عير بقطر 0.8 ملم و 4 ملم المسافة بينهما ، وتهيئة المجال الكهربائي لحوالي 88 سم / V بين الأقطاب وΔΦ حمل. يوصف مجال توزيع الدقيق بين الأقطاب الكهربائية المستخدمة في هذه التجربة في مكان آخر [1].
- العثور على خلايا الفائدة. تطبيق نبضة واحدة الكهربائية أو سلسلة من البقوليات. عن كل نبضة ، والحصول على صورتين مضان : واحد مباشرة قبل نبض (الصورة تحكم) ، ونبض واحد خلال (صورة النبض). نظرا لانخفاض استجابة دى ANEPPS - 8 ، والتغيرات في مضان يصعب تمييز بالعين المجردة ، وتصبح واضحة y. قلذ بعد المعالجة. يجب أن تكون متزامنة مع التسليم نبض الحصول على الصور ، والذي هو سمة من سمات برنامج الاقتناء. لتجنب photobleaching التدفئة وممكن ، ويمكن أن تقتصر على الإضاءة على مدة النبض.
الجزء الرابع : معالجة الصور وتحليلها
- فتح الصور في برنامج MetaMorph. عن كل نبضة ، طرح الخلفية في السيطرة على السواء وصورة النبض.
- اختيار الخلية وتعيين المنطقة ذات الاهتمام بحيث يتوافق مع الغشاء. قياس كثافة مضان على طول هذه المنطقة في صورة رقابة والنبض ونقل القيم إلى جدول بيانات.
- عن كل نبضة ، طرح بيانات التحكم من البيانات النبض ، وتقسيم النتيجة عن طريق التحكم في بيانات للحصول على التغيرات النسبية مضان. إذا تم تطبيق سلسلة من البقول ، ويمكن حساب متوسط القيم النسبية للتغيرات مضان المقررة لكل نبضة للحصول على قياس أكثر موثوقية.
- تحويل التغيرات النسبية في مضان ΔΦ باستخدام منحنى المعايرة. ويمكن الحصول على تقدير تقريبي لهذا المنحنى من الأدب ، ولكن لزيادة الدقة ، وأنه لا بد من قياس لكل نمط معين. للخلايا والإعداد المستخدمة في هذه التجربة انخفاضا بنسبة 6 ٪ في مضان يتوافق مع زيادة بنسبة 100 في بالسيارات [2] ΔΦ.
- أخيرا ، مؤامرة الجهد كدالة لطول قوس النسبي في حزمة برامج الرسوم البيانية مثل اكسل (مايكروسوفت ، ريدموند ، واشنطن ، الولايات المتحدة) ، السيدة سيغما قطعة (Systat البرمجيات ، وشركة سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) ، أو المنشأ (OriginLab كورب ، نورثهامبتون ، MA ، الولايات المتحدة). ويمكن أيضا أن تكون ممهدة المنحنى باستخدام مرشح مناسب ، مثل تصفية المتوسط المتحرك.
Discussion
ويمكن قياس الغشاء المستحث (عبر الغشاء) الجهد ، ΔΦ ، يكون من المهم في ضبط التجريبية المختلفة ، مثل الدراسات قنوات الغشاء الجهد مسور ، ونشر عمل محتمل ، تحفيز خلايا القلب ، أو خلية غشاء electroporation [3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7]. مع الخلية الأشكال البسيطة ، يمكن أن تحسب ΔΦ تحليلي. على سبيل المثال ، لخلية كروية ، تعطى عن طريق المعادلة ΔΦ شوان ليالي ، التي تنص على أن الجهد يتناسب مع شدة المجال وحجم الخلية ويلي الدالة جيب التمام على طول الغشاء [8 ، 9]. لمزيد من الأشكال خلية معقدة ، ويمكن أن تنحرف ΔΦ كبيرا من جيب التمام ، ويجب أن تحدد إما عدديا ، وذلك باستخدام جهاز كمبيوتر [2 ، 10 ، 11] ، أو تجريبيا ، وذلك باستخدام صبغة potentiometric [12 ، 13 ، 14 ، 15].
واحدة من الأصباغ potentiometric استخداما لهذا الغرض هي دي - 8 - ANEPPS (دي - 8 - بوتيل - الأميني النفثول - الاثيلين pyridinium - بروبيل سلفونات) ، صبغة سريع مع الإثارة وانبعاث أطياف تعتمد على الجهد الغشاء ، الذي يسمح الملاحظات موسع للتغيرات في ΔΦ على غشاء الخلية وقياس قيمته. في هذا الفيديو ، وتبين لنا مقاربة تجريبية لتحديد ΔΦ باستخدام دي - 8 - ANEPPS.
وقد وضعت الصبغة البروفيسور ليزلي لوف وزملاؤه [13 ، 14] في جامعة كونيتيكت ، وينتمي إلى فئة من الاستجابة السريعة الأصباغ. دي - 8 - ANEPPS هو nonfluorescent في الماء وتصبح الفلورسنت بقوة عندما يدمج في طبقة ثنائية المادة الدهنية في غشاء الخلية. أي تغيير في النتائج ΔΦ في تغيير توزيع تهمة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ والتغيرات المناظرة في ملف الطيفية وكثافة مضان الصبغة ل. كثافة مضان من دى ANEPPS - 8 يختلف نسبيا إلى تغيير ΔΦ ، واستجابة للصباغة خطي لالفولتية تتراوح بين -280 إلى +250 بالسيارات بالسيارات [4 ، 16]. تغييرات صغيرة نسبيا في مضان للصباغة ، تلوين الغشاء متفاوتا ، واستيعاب صبغ جعل دي - 8 - ANEPPS أقل ملاءمة للمقاييس مطلقة من الجهد الغشاء ، مثلا عنصرها يستريح ، على الرغم من وأفادت التقارير أيضا هذه الجهود [17]. هو عليه ، ومع ذلك ، ومناسبة لقياس التغيرات في الجهد الأكبر الغشاء ، مثل بداية الجهد المستحث في غشاء الخلايا nonexcitable تتعرض لمجالات كهربائية الخارجية [12 ، 13] ، أو إمكانات العمل في الخلايا منفعل [4 ، 5]. وإن لم تطبق هنا ، دي - 8 - ANEPPS كما يسمح تصميم ΔΦ بواسطة القياسات ratiometric من الإثارة مضان [18] أو الانبعاثات [19] ، مما يزيد من الحساسية للاستجابة ، ويقلل من الآثار المذكورة أعلاه. كما دي - 8 - ANEPPS البقع الغشاء ، يمكن أن تستخدم أيضا بوضوح كعلامة الغشاء [2].
واحدة من المآخذ على الصبغة هو أنه عرضة للphotobleaching ، بحيث يجب تجنب التعرض لفترات طويلة لضوء قوي. تتم معايرة الصبغة إما مع valinomycin (ط) ionophore البوتاسيوم ومجموعة من تركيزات مختلفة من البوتاسيوم المتوسط الخارجية [2،18] ، أو (ب) التصحيح ، المشبك المشبك في وضع التيار الكهربائي [17].
أخيرا ، مع قياسات ΔΦ على الخلايا والخلايا كروية الأشكال أكثر تعقيدا ، والفيديو يوضح تأثير شكل الخلية على التوزيع المكاني للالسعة وΔΦ. وبالتالي لخلايا كروية ΔΦ قريب من جيب التمام ، وذلك بالاتفاق مع شفان المعادلة ، في حين لأكثر الأشكال تعقيدا الخلية التوزيع المكاني للΔΦ هو أكثر تعقيدا [20]...
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل وكالة أبحاث السلوفيني مع المشروع Z2 - 9229 - P2 وبرنامج 0249. هذا الفيديو يمثل المواد التكميلية عن "تقنيات Electroporation القاعدة والعلاج" ورشة عمل علمية ودورة الدراسات العليا ، نظمت كل سنتين في كلية الهندسة الكهربائية في جامعة ليوبليانا ، سلوفينيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery. J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).
- Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells. Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).
- Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential. Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).
- Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. Distinct electric potentials in soma and neurite membranes. Neuron. 13, 1187-1193 (1994).
- Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells. Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).
- Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. Electropermeabilization of cell membranes. Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).
- Sersa, G., Miklavčič, D. Electrochemotherapy of tumours. JoVE. 22, (2008).
- Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis. Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).
- Schwan, H. P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).
- Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. An approach to electrical modeling of single and multiple cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).
- Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation. IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).
- Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields. Biophys. J. 50, 339-348 (1986).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).
- Loew, L. M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields. Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).
- Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys. J. 59, 209-220 (1991).
- Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields. Biophys. J. 56, 121-128 (1989).
- Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons. Biophys. J. 74, 48-53 (1998).
- Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential. Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).
- Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).
- Pucihar, G., Miklavčič, D. A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells. IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).
