Summary
Extern elektrisch veld induceert een spanning op het membraan van een cel, de zogenoemde geïnduceerde membraan spanning (ΔΦ). Door het gebruik van de potentiometrische kleurstof di-8-ANEPPS, is het mogelijk om de ΔΦ niet-invasief te meten. Deze video toont het protocol voor het meten van ΔΦ met behulp van di-8-ANEPPS.
Abstract
Plaatsing van een cel in een extern elektrisch veld veroorzaakt een plaatselijke heffing herverdeling binnen en buiten de cel in de buurt van de celmembraan, wat resulteert in een spanning over het membraan. Deze spanning, de zogenoemde geïnduceerde membraan spanning (ook veroorzaakt transmembraan spanning, of geïnduceerde transmembraan potentiaal verschil) en aangeduid met ΔΦ, bestaat alleen zolang de externe veld aanwezig is. Als de rust spanning aanwezig is op het membraan, de geïnduceerde spanning superimposes (voegt) op het. Door het gebruik van een van de potentiometrische fluorescerende kleurstoffen, zoals di-8-ANEPPS, is het mogelijk om de variaties van ΔΦ op het celmembraan te observeren en om de waarde ervan niet-invasief te meten. di-8-ANEPPS wordt sterk fluorescerend wanneer gebonden aan de lipide dubbellaag van het celmembraan, met de verandering van de fluorescentie-intensiteit evenredig is met de verandering van ΔΦ. Deze video toont het protocol voor het meten van ΔΦ met behulp van di-8-ANEPPS en toont ook aan de invloed van de cel vorm op de amplitude en de ruimtelijke verdeling van ΔΦ.
Protocol
Deel I: Voorbereidende stappen
- In dit experiment Chinese hamster ovarium cellijn (CHO-K1) wordt gebruikt. Cellen worden uitgeplaat in Lab-Tek II kamers (twee waterputten, 4 cm 2 elk) (Nalge Nunc, Duitsland) op ~ 0.7x10 5 cellen / ml in HAM-F12 kweekmedium aangevuld met 8% foetaal kalf serum, 0,15 mg / ml L-glutamine, 16 mg / ml gentamicine (alle van Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), en 200 eenheden / ml Crystacillin (Pliva, Zagreb, Kroatië), en geïncubeerd in 5% CO 2 bij 37 ° C. Als alternatief kunnen cellen ook worden uitgeplaat op # 1 glas dekglaasjes (0,13 tot 0,16 mm dik), bekleed met een cellulaire lijm, zoals polylysine.
- Incubeer de cellen in hun cultuur medium. Incubatie van 2 tot 4 uur levert cellen die nog steeds zijn ongeveer bolvormig, maar stevig aan het oppervlak met een klein deel van hun membraan. U kunt ook na 16 tot 20 uur incubatie, worden de cellen volledig aan de oppervlakte en hebben meer complexere vormen, maar de meeste van hen zijn nog steeds niet te delen.
- Bereid een 10 mM voorraad oplossing van di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) door de toevoeging van 843 ul van DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) tot 5 mg van de kleurstof in de originele Invitrogen flacon. De voorraad-oplossing kan worden opgeslagen in een koelkast bij 4 ° C voor enkele maanden. Voordat u begint met de experimenten, warming-up van de de oplossing tot de kristallen van DMSO op te lossen.
- Sommige cellijnen kunnen vereisen het gebruik van Pluronic om de kleurstof opname gemak in het celmembraan. Pluronic kunnen worden gekocht in 20% voorraad-oplossing in DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, USA), of een voorraad oplossing van de zelfde concentratie kan worden bereid door het oplossen van pluronic in DMSO. Stock oplossing van Pluronic kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur.
Deel II: Het laden van de cellen met di-8-ANEPPS
- Mix 3 pl van 10 mM di-8-ANEPPS en 2,5 pl van 20% Pluronic in 1 ml van de Spinner wijziging (calcium-uitgeput versie) van de Minimum Essential Medium SMEM (medium M8167 of M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland ) in een 1,5 ml Eppendorf buis. Dit levert een "laad-oplossing" met ongeveer 30 uM di-8-ANEPPS en 0,05% van Pluronic. Voor andere soorten cellen, kunnen hun eigen cultuur media in plaats van SMEM worden gebruikt.
- Vervang het kweekmedium in het Lab-Tek kamer met het laden oplossing. Overdracht van de kamer naar de koelkast voor 10 min bij 4 ° C. Bij deze temperatuur is internalisatie van de kleurstof door het plasmamembraan grotendeels geremd.
- Na het kleuren, voorzichtig te wassen de overtollige kleurstof twee tot drie keer met zuivere SMEM.
- Laat 1,5 ml van SMEM in de kamer.
Deel III: Experiment en beeldacquisitie
- De cellen worden waargenomen met behulp van een fluorescentie microscoop (in ons geval Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Duitsland), uitgerust met een olie-immersie objectief (X63, NA 1.4), een monochromator (Polychrome IV, Visitron, Duitsland) en een gekoelde CCD-camera (VisiCam 1280, Visitron, Duitsland). De beelden worden verkregen met MetaFluor 7.1.1 en verwerkt in Metamorph 7.1.1 (beide Molecular Devices, Downingtown, PA, USA), maar ook andere soortgelijke acquisitie software kan ook worden gebruikt. Stel de golflengte in de acquisitie software om 490 nm en kies een geschikte emissie-filter voor ANEPPS, bijvoorbeeld, een band-pass filter gecentreerd op 605 nm (605/55m, dichroïsche 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, USA). Als een monochromator niet beschikbaar is, kan een excitatiefilter gecentreerd op 490 nm in plaats daarvan worden gebruikt.
- Plaats de kamer met cellen op de microscoop podium, plaatst u de elektroden op de bodem van de kamer en sluit ze aan op de pulsgenerator. Het medium moet betrekking hebben op de elektroden.
- Te behouden levensvatbaarheid van de cellen en vermindering van de verwarming, moet de hartslag worden van voldoende lage amplitude en korte duur. In dit experiment een vierkant puls met 35 V amplitude en duur van 50 ms (laag genoeg is om te vermijden elektroporatie) is gegenereerd met behulp van een DC-voeding en een op maat gemaakte microprocessor gestuurde switcher apparaat. Als alternatief, een commercieel pulsgenerator, zoals 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) aangesloten op een versterker of een commerciële stimulator, zoals de S88 (Grass, West Warwick, RI, USA), kan worden gebruikt. De puls wordt geleverd aan twee parallelle Pt / Ir draadelektroden met 0,8 mm diameter en 4 mm afstand tussen hen, het creëren van een elektrisch veld van ongeveer 88 V / cm tussen de elektroden en het induceren van ΔΦ. De precieze verdeling veld tussen de elektroden gebruikt in dit experiment is elders [1] beschreven.
- Zoek de cellen van belang. Breng een enkele elektrische puls of een reeks van pulsen. Voor elke puls, te verwerven twee fluorescentie beelden op: een vlak voor de puls (de controle-beeld), en een tijdens de puls (de pols afbeelding). Vanwege de lage respons van de di-8-ANEPPS, de veranderingen in de fluorescentie zijn moeilijk te onderscheiden met het blote oog en duidelijk worden only na verwerking. De puls levering moet worden gesynchroniseerd met het beeld overname, die is een kenmerk van de acquisitie software. Om te voorkomen dat fotobleken en mogelijke verwarming, de verlichting kan worden beperkt tot de duur van de puls.
Deel IV: Image verwerking en analyse
- Open de afbeeldingen in Metamorph software. For elke puls, aftrekken van de achtergrond in zowel de controle en de pols beeld.
- Kies een cel en stel de regio van belang, zodat het overeenkomt met het membraan. Meet de fluorescentie-intensiteiten langs deze regio in de controle en pols beeld en overdracht van de waarden naar een spreadsheet.
- Voor elke puls, af te trekken van de controle van gegevens uit de pols gegevens, en deelt het resultaat door controle van gegevens om de relatieve fluorescentie wijzigingen. Als er een reeks van pulsen wordt toegepast, kunnen de waarden van de relatieve fluorescentie veranderingen bepaald voor elke puls worden gemiddeld tot een meer betrouwbare meting te krijgen.
- Transformeren van de relatieve fluorescentie verandert in ΔΦ met behulp van een kalibratiecurve. Een ruwe schatting van deze curve kan worden verkregen uit de literatuur, maar voor een hogere nauwkeurigheid, moet worden gemeten voor elke specifieke setup. Voor de cellen en de setup die in dit experiment een 6% daling van de fluorescentie komt overeen met een 100 mV toename van de ΔΦ [2].
- Tot slot, plot de spanning als functie van de relatieve booglengte in een grafische software-pakket zoals Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA, USA), Sigma Plot (systat Software Inc, San Jose, CA, USA), of Oorsprong (OriginLab Corp, Northampton, MA, USA). De curve kan ook worden gladgestreken met behulp van een geschikt filter, zoals het voortschrijdend gemiddelde filter.
Discussion
Metingen van de geïnduceerde membraan (transmembraan) spanning, ΔΦ, kan belangrijk zijn in verschillende experimentele instellingen, zoals de studies van de voltage-gated kanalen membraan, actiepotentiaal voortplanting, cardiale cel stimulatie, of celmembraan elektroporatie [3, 4, 5, 6 , 7]. Met eenvoudige cel vormen, kan ΔΦ analytisch worden berekend. Bijvoorbeeld, voor een bolvormige cel, wordt ΔΦ gegeven door vergelijking van de Schwan s, waarin staat dat de spanning is evenredig met de veldsterkte en de celgrootte en volgt de cosinus functie langs het membraan [8, 9]. Voor meer ingewikkelde cellen vormen, kan ΔΦ aanzienlijk afwijken van de cosinus en moet ofwel numeriek worden bepaald met behulp van een computer [2, 10, 11], of experimenteel, met behulp van een potentiometrische kleurstof [12, 13, 14, 15].
Een van de potentiometrische kleurstoffen grote schaal gebruikt voor dit doel is di-8-ANEPPS (di-8-butyl-amino-naftyl-ethyleen-pyridinium-propyl-sulfonaat), een snelle kleurstof met excitatie en emissie spectra afhankelijk van het membraan spanning, die het mogelijk maakt niet-invasieve opmerkingen van de variaties van de ΔΦ op de celmembraan en de waarde ervan te meten. In deze video, tonen we een experimentele aanpak voor bepaling van ΔΦ door gebruik te maken di-8-ANEPPS.
De kleurstof werd ontwikkeld door professor Leslie Loew en collega's [13, 14] aan de Universiteit van Connecticut en behoort tot de klasse van de snelle respons kleurstoffen. di-8-ANEPPS is nonfluorescent in het water en wordt sterk fluorescerende wanneer het wordt opgenomen in de lipide dubbellaag van de celmembraan. Een verandering in ΔΦ resulteert in een verandering van de intramoleculaire ladingsverdeling en de bijbehorende veranderingen in de spectrale profiel en de intensiteit van de fluorescentie van de kleurstof's. De fluorescentie-intensiteit van di-8-ANEPPS varieert in verhouding tot de verandering van ΔΦ, de reactie van de kleurstof is lineair voor spanningen, variërend van -280 mV tot +250 mV [4, 16]. Relatief kleine veranderingen in fluorescentie van de kleurstof, ongelijke membraankleuring, en kleurstof internalisatie maken di-8-ANEPPS minder geschikt voor de absolute metingen van membraan spanning, bijvoorbeeld de rust component, maar deze pogingen werden ook gemeld [17]. Het is echter geschikt voor het meten van grotere veranderingen in de membraan spanning, zoals het begin van geïnduceerde membraan spanning in nonexcitable cellen blootgesteld aan externe elektrische velden [12, 13], of actiepotentialen in prikkelbare cellen [4, 5]. Hoewel het hier niet toegepast, di-8-ANEPPS maakt het ook mogelijk de bepaling van de ΔΦ door ratiometrische metingen van de fluorescentie excitatie [18] of emissie [19], die verhoogt de gevoeligheid van de reactie en vermindert de bovengenoemde effecten. Als di-8-ANEPPS vlekken het membraan, het kan ook duidelijk worden gebruikt als een membraan marker [2].
Een van de nadelen van de kleurstof is dat het gevoelig is voor photobleaching, zodat dat langdurige blootstelling aan het sterke licht moeten worden vermeden. Kalibratie van de kleurstof wordt uitgevoerd met ofwel (i) kalium ionofoor valinomycin en een set van verschillende kalium concentraties in externe medium [2,18], of (ii) patch-clamp in spanning klem mode [17].
Ten slotte is met de metingen van ΔΦ op de sferische cellen en cellen van meer complexe vormen, de video toont de invloed van de cel vorm op de amplitude en de ruimtelijke verdeling van ΔΦ. Dus voor bolvormige cellen ΔΦ is dicht bij een cosinus, in overeenstemming met vergelijking Schwan's, terwijl voor de meer gecompliceerde cellen vormen de ruimtelijke verdeling van ΔΦ is ingewikkelder [20] ...
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Sloveense Research Agency met project-Z2 9.229 en programma P2-0249. Deze video staat voor het aanvullende materiaal voor de "Elektroporatie-based technologieën en behandelingen 'wetenschappelijke workshop en de postdoctorale opleiding, tweejaarlijks georganiseerd door de faculteit Elektrotechniek aan de Universiteit van Ljubljana, Slovenië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery. J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).
- Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells. Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).
- Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential. Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).
- Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. Distinct electric potentials in soma and neurite membranes. Neuron. 13, 1187-1193 (1994).
- Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells. Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).
- Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. Electropermeabilization of cell membranes. Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).
- Sersa, G., Miklavčič, D. Electrochemotherapy of tumours. JoVE. 22, (2008).
- Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis. Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).
- Schwan, H. P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).
- Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. An approach to electrical modeling of single and multiple cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).
- Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation. IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).
- Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields. Biophys. J. 50, 339-348 (1986).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).
- Loew, L. M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields. Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).
- Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys. J. 59, 209-220 (1991).
- Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields. Biophys. J. 56, 121-128 (1989).
- Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons. Biophys. J. 74, 48-53 (1998).
- Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential. Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).
- Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).
- Pucihar, G., Miklavčič, D. A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells. IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).
