Summary
مظاهرة للعزلة من الحبل الشوكي لفأر الولدان الدراسات الكهربية.
Abstract
الحبل الشوكي الماوس الولدان هو نموذج لدراسة وضع circuitries العصبي الحركي والحركة. نحن لشرح تشريح النخاع الشوكي وإعداد حمام تسجيل الاصطناعية المستخدمة في السائل النخاعي الدراسات الحركي. تشريح مرة واحدة ، يمكن أن يعلق الحبل الشوكي جذور الاعصاب الاماميه الى القطب التسجيل لتسجيل الإشارات الكهربية من الدوائر نمط توليد مركزية داخل الحبل القطني.
Protocol
1. إعداد الاصطناعي السائل النخاعي (aCSF) 1. نحن نستعد لأول مرة 2L بمخزون 10X من دون aCSF المغنيسيوم أو الكالسيوم. الكواشف المدرجة في millimolar. الأرقام تشير إلى كتالوج سيغما / الدريتش.
| 2 ليتر aCSF 10X (بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم) | |||
| الكاشف | ملي | g/2L | فهرس |
| بوكل | 40 | 5.96 | P - 9333 |
| كلوريد الصوديوم | 1280 | 149.61 | S - 7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35.28 | S - 6297 |
| ناه 2 ص 4 | 5 | 1.38 | S - 9638 |
| جلوكوز | 300 | 108.12 | D - 9434 |
| إضافة الماء المقطر ل2L | |||
سوف نقوم أيضا بإعداد حلول 1M من MgSO 4 و CaCl 2 في 50mL المياه للسماح بإجراء تعديلات في molarity من التجربة والتجربة لضمان الكالسيوم يبقى في الحل.
| 1M الكالسيوم والمغنيسيوم مخزون | |||
| الكاشف | M | g/50mL | فهرس |
| CaCl 2 | 1 | 7.35 | C - 5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12.33 | M - 5921 |
يجب أن يكون الحل aCSF بالغاز مع كربوجين (95 ٪ / O2 CO2 5 ٪) لخفض درجة الحموضة قبل إضافة الكالسيوم أو الكالسيوم سوف يعجل.
| 1 ليتر aCSF | |
| الكاشف | حجم |
| 10X aCSF | 100ML |
| 1M CaCl 2 | 1 مل (تشريح) 2mL (تسجيل) |
| 1M MgSO 4 | 1 مل |
| إضافة ~ 800 مل من الماء المقطر ، والغاز مع كربوجين لمدة 2 دقيقة قبل ان يضيف الكالسيوم | |
| إضافة الماء المقطر ل1L. | |
يجب شطف مضخات وأنابيب وأطباق تشريح قبل وبعد الاستخدام.
تشريح
بينما تشريح ، ينبغي 1MM الكالسيوم aCSF بالغاز باستمرار مع كربوجين. ويمكن تحويله إلى aCSF من زجاجة إلى طبق تشريح وضخها من الطبق تشريح لزجاجة أو إرسالها إلى النفايات. نستخدم الاستومر (Sylgard ، داو كورننغ) طبق المغلفة لإجراء تشريح.
غير مقطوعة الرأس بسرعة الماوس الوليد مع مقص حاد ، والمصنوعة من شق طريق المقص الصدر والبطن البطني. ومن ثم ينتزع منه الحيوان. يتم شطف الماوس مع aCSF ينتزع منه. ثم يعلق هو الحيوان إلى الطبق مع دبابيس تشريح الحشرات من خلال إدراج الأمامية وعند قاعدة الذيل.
تتم إزالة العمود الفقري عن طريق إجراء الثقب البطني. يقام في العمود الفقري مع ملقط صغير ويتم إدراج شفرة واحدة من مقص صغير الظهرية فورا إلى العمود الفقري العظمي. هو قطع الصفيحة على جانب واحد ثم الآخر بلطف بينما رفع العمود الفقري عظمي. ويتم هذا خارج عن طول العمود الفقري.
تتم إزالة الحبل الشوكي عن طريق قطع على طول جانبي العمود الفقري لقطع جذور العصب الشوكي والسحايا المحيطة قطع الحبل الشوكي. قطعنا على الجانبين الأيسر والأيمن ، ثم قص علينا السحايا تعلق على الجانب الظهري في النخاع الشوكي لاطلاق سراحه. ويعلق ثم سلك معزول إلى الطبق بالقرب من مدخل aCSF جيدة لإعطاء الأوكسجين إذا تشريح الحيوانات إضافية.
ثم يتم نقل النخاع الشوكي لعزل طبق تسجيل باستخدام ملعقة صغيرة أو الملعقة. نحن هنا يروي إعداد مع الاوكسيجين aCSF 2mm والكالسيوم. وعلقت الحبل الشوكي إلى الطبق الاستومر micromanipulators المغلفة وتستخدم لنقل خارج الخلية ، شفط الجذر كله أقطاب بالقرب من الجذور. عند طرف القطب هو قرب نهاية الجذر الحر ، يتم تطبيق الشفط اللطيف لرسم الجذرية في القطب الشفط. ويمكن تكرار هذه العملية لتسجيل جذور عدة في وقت واحد.
الشكل 1. قطع الرأس ونزع الأحشاء ألف. بسرعة بقطع رأس الفأر مع مقص حاد. ويمكن تحقيق مساهمات أكبر أو أقل من جذع الدماغ اعتمادا على خفض مستوى. باء مكان واحد شفرة المقص في افتتاح التجويف الصدري إنشاؤها بواسطة قطع الرأس. فتح الصدر والبطن بطني الى قاعدة الذيل. إزالة الأحشاء وشطف مع aCSF.
الشكل 2. إزالة ألف عمود. الشوكي إدراج شفرة المقص الأيسر للفي المسافة بين العمود الفقري والنخاع الشوكي للحق وقطع الحبل الشوكي من خلال زرع عظام البطني للنخاع. ثم أدخل شفرة المقص الأيمن من في المسافة بين العمود الفقري والنخاع الشوكي الى اليسار من الحبل الشوكي وقطع. باء كرر هذه العملية مع تطبيق الجر لطيف إلى العمود الفقري. الحرص على عدم ثقب في النخاع الشوكي من خلال عقد مقص بزاوية منخفضة.
الشكل 3. إزالة الحبل الشوكي ألف. إدراج شفرة المقص الأيسر للفي الفضاء بين النخاع الشوكي والعظام إلى اليمين من الحبل الشوكي والجذور من خلال قطع الحبل الشوكي والسحايا زرع الوحشي للنخاع. ثم أدخل شفرة المقص الأيمن من في الفضاء بين النخاع الشوكي والعظام وإلى اليسار من الحبل الشوكي والجذور من خلال قطع الحبل الشوكي والسحايا زرع الوحشي للنخاع. باء وأخيرا ، ورفع الحبل بلطف منقاري وقطع الحبل السري الذي يربط بين السحايا الظهرية للصفيحة. مرة أخرى اتخاذ الحرص على عدم ثقب في النخاع الشوكي من خلال عقد مقص بزاوية منخفضة. لا تقطع جذور قريبة جدا من النخاع الشوكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المعزولة الحبل الشوكي الولدان يوفر طريقة الانقياد لدراسة الجهاز العصبي development1 النظام ، 2. داخل النخاع الشوكي القطني من القوارض حديثي الولادة ، يمكن أن الدوائر المركزية لتوليد نمط إنتاج تنقل الوهمية في وجود العصبية. هذا تحرك الوهمية يتكون من الزيادات في النشاط الإيقاعي ، رشقات نارية ، التي يتم إنتاجها في 0،2-0،5 هرتز. ويتم تنظيم هذه رشقات نارية لإنتاج التناوب بين اليمين واليسار على طول الحبل التناوب والمثنية الباسطة - (L2 المماثل بالنسبة إلى L5). وقد أظهرت العديد من الطفرات الجينية في الفئران أن السلوك الشاذ 3-5. وسوف تفهم كيف يتم تبديل الدوائر العصبية من الحبل الشوكي أثناء تطوير والاضطرابات الوراثية تبلغ دراسات الدوائر العصبية في أماكن أخرى من الجهاز العصبي المركزي.
ومن الجدير بالذكر أن هناك العديد من الحلول القياسية aCSF في الاستخدام المنتظم. أقل من جدول الأعمال التحضيرية aCSF مستخدمة بشكل شائع.
الجدول رقم 1 : التراكيب المشتركة aCSF
| مختبر | aCSF التأليف في ملي |
| فاف ، أودونوفان ، Landmesser (3) | 128 كلوريد الصوديوم ، 4 بوكل ، 1.5 CaCl 2 ، 1 MgSO 4 ، 0.5 ناه 2 ص 4 ، 21 NaHCO 3 ، 30 الجلوكوز. |
| غولدينغ ، Keihn (5) | 111 كلوريد الصوديوم ، بوكل 3.08 ، 2.52 CaCl 2 ، 1.25 MgSO 4 ، 1.18 KH 2 PO 4 ، 25 NaHCO 3 ، 11 السكر |
| الحجر البني (6) | 127 كلوريد الصوديوم ، 1،9-3،9 بوكل ، 1.2 KH 2 PO 4 ، 2.4 CaCl 2 ، 1.3 MgCl 2 و 26 NaHCO 3 ، 10 السكر |
| Ziskind - Conhaim تشريح (7) | كلوريد الصوديوم 113 ، 3 بوكل ، 1 CaCl 2 ، 6 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 ، 1 ص ناه 2 4 ، 11 السكر |
| Ziskind - Conhaim خارج الخلية (7) | كلوريد الصوديوم 113 ، 3 بوكل ، 2 CaCl 2 ، 1 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 ، 1 ص ناه 2 4 ، 11 الجلوكوز. |
| أودونوفان ، الفرخ (8،9) | 139 كلوريد الصوديوم ، 2،9-5 بوكل ، 17 NaHCO 3 ، 1 MgCl 2 ، 3 CaCl 2 ، 12 السكر |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
رعاية الحيوان
Acknowledgments
صامويل فاف وهو أستاذ في مختبرات التعبير الجيني في معهد سالك للدراسات البيولوجية ومحقق في معهد هوارد هيوز الطبي. وأيد هذا العمل من قبل كريستوفر ودانا ريف مؤسسة. قدم جو Belcovson ، Schnoeker كينت ومايك سوليفان في الموارد الوسائط المتعددة في معهد سولك المساعدة في التصوير والتحرير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
