Summary
electrophysiologic 연구 신생아 마우스 척수의 고립의 데모.
Abstract
신생아 마우스 척수는 신경 circuitries과 전위의 운동의 발전을위한 연구 모델입니다. 우리는 척수의 해부와 전위의 연구에 사용되는 기록 목욕 인공 뇌척수의 준비를 보여줍니다. 일단 해부, 척수 복부 신경 뿌리는 허리 코드 내에서 중앙 패턴 생성 회로의 electrophysiologic 신호를 기록하는 기록 전극을 부착하실 수 있습니다.
Protocol
1. 인공 뇌척수 (aCSF 1)를 준비합니다. 우리가 먼저 마그네슘 또는 칼슘없이 aCSF의 10X 주식 2L를 준비합니다. 시약은 millimolar에 나열된. 카탈로그 번호 시그마 / 알드리치를 참조하십시오.
| 2 리터는 10X aCSF (MG 또는 칼슘 제외) | |||
| 시약 | MM | g/2L | 목록 |
| KCl | 40 | 5.96 | P - 9333 |
| NaCl | 1280 | 149.61 | S - 7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35.28 | S - 6297 |
| 아니 2 PO 4 | 5 | 1.38 | S - 9638 |
| 포도당 | 300 | 108.12 | D - 9434 |
| 2L에 증류수를 추가 | |||
우리는 또한 실험에서 실험 molarity을 조정 수 있도록 50mL 물에 MgSO 4 CaCl 2 1M 솔루션을 준비하고 칼슘 용액에 남아 확신합니다.
| 1M 칼슘과 마그네슘 주식 | |||
| 시약 | M | g/50mL | 목록 |
| CaCl 2 | 1 | 7.35 | C - 5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12.33 | M - 5921 |
aCSF 솔루션은 침전됩니다 칼슘이나 칼슘을 추가하기 전에 산도를 낮게 carbogen (95% O2 / 5 % CO2)와 기름해야합니다.
| 1 리터 aCSF | |
| 시약 | 음량 |
| 10X aCSF | 100mL |
| 1M CaCl 2 | 1 ML (해부) 2mL (녹음) |
| 1M MgSO 4 | 1 ML |
| 칼슘을 추가하기 전에 ~ 800 ML 증류수, 2 분 동안 carbogen와 가스 추가 | |
| 1L에 증류수를 추가합니다. | |
펌프와 관 그리고 해부 접시는 사용 전후에 씻어서해야합니다.
해부
해부 동안 1mM 칼슘 aCSF는 지속적으로 carbogen와 기름해야합니다. aCSF은 해부 접시에 한 병에서 siphoned 및 병에 대한 해부 접시에서 펌프 또는 폐기물로 보낼 수 있습니다. 우리는 탄성체 (Sylgard, 다우 코닝) 절개를 수행하기 위해 코팅 접시를 사용합니다.
신생아 마우스는 급속하게 날카로운 가위와 복부 흉부와 복부를 통해 가위로 만든 절개와 목이있다. 동물 그러면 eviscerated됩니다. eviscerated 마우스 aCSF로 씻어서 있습니다. 동물은 다음 앞발 통해 꼬리의 기지에 삽입 곤충 핀으로 해부 접시에 박혀있다.
척추는 복부 laminectomy를 수행하여 제거됩니다. 척추 열은 작은 집게와 함께 개최되는 작은 가위 하나 블레이드는 뼈에 척수 컬럼에 즉시 지느러미 삽입됩니다. 부드럽게 뼈다귀 척추 컬럼을 리프팅하는 동안 라미나 그런 다음 한쪽과 다른 한편으로는 상처입니다. 이것은 척추의 길이에 대해 수행됩니다.
척수는 척수 신경 뿌리를 끊어와 척수를 둘러싼 meninges를 잘라 척수의 양쪽을 따라 커팅에 의해 제거됩니다. 우리는 왼쪽과 오른쪽 양쪽에 상처, 우리는 그것을 무료로 척수의 지느러미 측면에 부착된 meninges를 잘라. 절연 코드는 다음 추가 동물 해부하는 경우 좋은 산소를 보장하기 위해 aCSF 입구 근처에있는 접시에 박혀있다.
분리된 척수는 다음 작은 숟가락이나 주걱을 사용하여 녹음 요리로 전송됩니다. 여기 산소 2mM 칼슘 aCSF으로 준비를 perfuse. 척수는 탄성체 코팅 접시와 뿌리 근처 세포, 전체 루트 흡입 전극을 이동하는 데 사용 micromanipulators에 박혀있다. 전극 팁은 무료 루트 끝 가까이하면, 부드러운 흡입은 흡입 전극에 뿌리를 그릴에 적용됩니다. 이 과정은 동시에 여러 개의 뿌리를 기록하는 반복될 수 있습니다.
그림 1. 잘린과 내장 적출. A. 신속하게 날카로운 가위로 마우스를 목을 벨. 뇌간에서 크거나 낮은 기여 컷의 수준에 따라 형성될 수 있습니다. 잘린 만든 흉강의 개통에 가위 B. 플레이스 한 블레이드. 꼬리의 기본으로 복부 근육과 복부를 엽니다. 내장을 제거하고 aCSF와 린스.
그림 2. 척추. A. 제거 코드에 누워 복부 뼈를 통해 척수 및 절단의 오른쪽에있는 척추와 척수 사이의 공간에 가위의 왼쪽 날개를 삽입합니다. 다음 척수 및 절단의 왼쪽에있는 척추와 척수 사이의 공간에 가위의 오른쪽 날개를 삽입합니다. 척추 열 부드러운 견인을 적용하는 동안 B.이 과정을 반복합니다. 낮은 각도에서 가위를 들고하여 주사 척수 안됩니다.
그림 3. 척수의 제거. A. 척수와 코드에 측면 누워 척추 뿌리와 meninges 통해 척수 및 절단의 오른쪽에있는 뼈 사이의 공간에 가위의 왼쪽 날개를 삽입합니다. 다음 척수의 왼쪽에있는 척수와 뼈 사이의 공간에 가위의 오른쪽 날개를 삽입하고 코드에 측면 누워 척추 뿌리와 meninges 통해 했네요. B. 마지막으로, 부드럽게 주동이의 코드를 채취해서 laminae에 지느러미 코드를 연결 meninges를 잘라. 다시 낮은 각도에서 가위를 들고하여 주사 척수에 신경을 안 받아. 척수에 너무 가까이 뿌리를 잘라하지 마십시오.
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Discussion
절연 신생아 척수는 신경계의 development1, 2를 공부의 취급하기 쉬운 방법을 제공합니다. 신생아 설치류의 요추 척수 내에 중앙 패턴 생성 회로는 신경 전달 물질의 존재에 상상의 운동력을 생성하실 수 있습니다. 이 상상의 운동은 0.2-0.5 Hz에서에서 생산 활동에 리듬 증가, 파열로 이루어져 있습니다. 이러한 파열은 코드와 flexor - 신근 교대 (L5에 ipsilateral L2 상대)의 길이를 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 교대 생산 구성되어 있습니다. 마우스에 여러 유전자 돌연변이가 비정상적인 행동 3-5 가지고 보여왔다. 척수의 신경 회로가 개발 및 유전 perturbations 중에 변경하는 방법 이해하는 것은 다른 CNS에서 신경 회로의 연구를 통지합니다.
그것은 일반적인 사용 몇 가지 표준 aCSF 솔루션이있다는 것을 주목할 수 있습니다. 다음은 일반적으로 사용되는 aCSF 준비의 테이블입니다.
표 1 : 일반 aCSF의 성분
| 실험실 | MM의 aCSF 작문 |
| 파프, 도노반, Landmesser (3) | 128 NaCl, 4 KCl, 1.5 CaCl 2, 1 MgSO 4, 0.5 아니 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 포도당. |
| 굴딩스, Keihn (5) | 111 NaCl, KCl 3.08, 2.52 CaCl 2, 1.25 MgSO 4, KH 2 PO 1.18 4 25 NaHCO 3, 11 포도당 |
| 브라운 (6) | 127 NaCl, 1.9-3.9 KCl, 1.2 KH 2 PO 4, 2.4 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 10 포도당 |
| Ziskind - Conhaim의 해부 (7) | 113 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl 2, 6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 저질 2 PO 4, 11 포도당 |
| Ziskind - Conhaim 세포 (7) | 113 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 저질 2 PO 4, 11 포도당. |
| 도노반, 병아리, (8,9) | 139 NaCl, KCl 2.9-5, 17 NaHCO 3, 1 MgCl 2, 3 CaCl 2, 12 포도당 |
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Disclosures
애니멀 케어
Acknowledgments
사무엘 L. 파프는 생물 학적 연구 솔크 연구소에서 유전자 발현 연구소에서 교수와 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다. 이 작품은 크리스토퍼와 다나 리브 재단에 의해 지원되었다. 조 Belcovson, 켄트 Schnoeker와 솔크 연구소에서 멀티미디어 자원에 마이크 설리반은 사진 촬영 및 편집 지원을 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
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- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
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- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
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