Summary
A demonstração do isolamento do cabo do mouse neonatal espinhal para estudos eletrofisiológicos.
Abstract
O cabo do mouse neonatal espinhal é um modelo para estudar o desenvolvimento de circuitos neurais e movimento locomotor. Nós demonstramos a dissecção da medula espinhal e preparação de fluido cerebrospinal artificial banho de gravação usado para estudos locomotor. Uma vez dissecada, a medula espinhal raízes nervosas ventral pode ser ligado a um eletrodo de gravação para gravar os sinais eletrofisiológicos dos circuitos centrais de geração de padrões dentro da medula lombar.
Protocol
1. Prepare líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) 1. Primeiro preparar uma 2L de um estoque de ACSF 10X sem magnésio ou cálcio. Reagentes listados na milimolar. Números de catálogo referem-se a Sigma / Aldrich.
| 2 Litros ACSF 10X (sem Mg ou Ca) | |||
| Reagente | mM | g/2L | Catálogo |
| KCl | 40 | 5,96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149,61 | S-7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35,28 | S-6297 |
| NaH 2 PO 4 | 5 | 1,38 | S-9638 |
| Glicose | 300 | 108,12 | D-9434 |
| Adicionar água destilada para 2L | |||
Vamos também preparar soluções 1M de MgSO 4 e CaCl 2 em 50 mL de água para permitir ajustes na molaridade de experimento para experimento e para assegurar o cálcio permanece em solução.
| O cálcio 1M e Stocks Magnésio | |||
| Reagente | M | g/50mL | Catálogo |
| CaCl 2 | 1 | 7,35 | C-5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12,33 | M-5921 |
A solução deve ser ACSF gaseados com carbogênio (95% O2 / 5% CO2) para diminuir o pH antes da adição de cálcio ou o cálcio vai precipitar.
| 1 Litro ACSF | |
| Reagente | Volume |
| ACSF 10X | 100mL |
| CaCl 2 1M | 1 mL (dissecação) 2 ml (gravação) |
| 1M MgSO 4 | 1 mL |
| Adicionar ~ 800 mL de água destilada, o gás com carbogênio por 2 minutos antes da adição de cálcio | |
| Adicionar água destilada para 1L. | |
As bombas e tubos e pratos dissecar deve ser lavado antes e após o uso.
Dissecação
Enquanto dissecar, 1mM de cálcio ACSF deve ser continuamente gaseificada com carbogênio. O ACSF pode ser sugada da garrafa para o prato de dissecação e bombeada do prato de dissecação para o frasco ou enviados para o lixo. Usamos um elastômero (Sylgard, Dow Corning) prato revestido para realizar a dissecação.
O rato neonatal é rapidamente decapitado com uma tesoura afiada e uma incisão feita com tesoura através do tórax e abdômen ventral. O animal é então eviscerada. O rato eviscerado é lavado com ACSF. O animal é então presa ao prato dissecando com pinos de insetos inserido através da forelimbs e na base da cauda.
A coluna vertebral é removido através da realização de uma laminectomia ventral. A coluna vertebral é realizada com pinças pequenas e uma lâmina de tesoura pequena é inserido imediatamente dorsal à coluna vertebral óssea. A lâmina é cortada de um lado e depois o outro, enquanto delicadamente levantando a coluna vertebral óssea. Isto é realizado para o comprimento da coluna vertebral.
A medula espinhal é retirada por um corte ao longo de cada lado da medula espinhal para cortar as raízes nervosas da coluna vertebral e cortar as meninges ao redor da medula espinhal. Cortamos nos lados esquerdo e direito, então vamos cortar as meninges anexado ao lado dorsal da medula espinhal para libertá-la. O cabo isolado é, então, preso ao prato perto da entrada de ACSF para garantir boa oxigenação se os animais adicionais são dissecados.
O cabo isolado espinhal é então transferido para um prato de gravação usando uma pequena colher ou espátula. Aqui nós perfundir a preparação com oxigenada de cálcio 2mM ACSF. A medula espinhal é fixado ao prato elastômero revestido e micromanipuladores usado para mover extracelular, eletrodos de sucção toda raiz perto das raízes. Quando a ponta do eletrodo fica perto da extremidade da raiz livre, sucção suave é aplicada para desenhar a raiz para o eletrodo de sucção. Este processo pode ser repetido para gravar várias raízes simultaneamente.
Figura 1. Decapitação e evisceração. A. Rapidamente decapitar o mouse com uma tesoura afiada. Contribuições maior ou menor do tronco cerebral pode ser alcançada, dependendo do nível de corte. Coloque uma lâmina B. da tesoura na abertura da cavidade torácica, criado pela decapitação. Abrir o tórax e abdômen ventral à base da cauda. Retire as vísceras e lave com ACSF.
Figura 2. Remoção da coluna vertebral. A. Insira a lâmina da tesoura deixada no espaço entre a coluna vertebral e medula espinhal para a direita da medula espinhal e cortar os ossos postura ventral à medula. Em seguida, insira a lâmina da tesoura direito no espaço entre a coluna vertebral e medula espinhal para a esquerda da medula espinhal e corte. B. Repita esse processo durante a aplicação de tração suave para a coluna vertebral. Tome cuidado para não perfurar a medula espinhal, segurando a tesoura em um ângulo baixo.
Figura 3. Remoção da medula espinhal. A. Insira a lâmina da tesoura deixada no espaço entre a medula espinhal e os ossos para a direita da medula espinhal e cortar através das raízes espinhal e as meninges postura lateral para o cabo. Em seguida, insira a lâmina da tesoura direito no espaço entre a medula espinhal e os ossos para a esquerda da medula espinhal e cortar através das raízes espinhal e as meninges postura lateral para o cabo. B. Finalmente, levante suavemente o cabo rostral e cortar as meninges de conectar o cabo dorsal para as lâminas. Novamente tome cuidado para não perfurar a medula espinhal, segurando a tesoura em um ângulo baixo. Não corte as raízes muito perto da medula espinhal.
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Discussion
O cordão espinhal neonatal isolado fornece um método de estudar tractable Desenvolvimento1 sistema nervoso, 2. Dentro da medula espinhal de roedores lombar neonatal, gerando circuitos centrais padrão pode produzir locomoção fictícia na presença de neurotransmissores. Este locomoção fictícia consiste de aumentos na atividade rítmica, rajadas, que são produzidos em 0,2-0,5 Hz. Estas explosões são organizados para produzir esquerda-direita alternância ao longo do comprimento do cabo de alternância e flexores e extensores (relativo L2 ipsilateral a L5). Várias mutações genéticas em ratos tem sido demonstrado que têm um comportamento anormal 3-5. Compreensão de como os circuitos neurais da medula espinhal é alterada durante o desenvolvimento e perturbações genéticas informará estudos dos circuitos neurais em outras partes do SNC.
É notável que há várias soluções padrão ACSF em uso regular. Abaixo está uma tabela de preparações usadas ACSF.
Tabela 1: Composições Common ACSF
| Laboratório | ACSF Composição em mM |
| Pfaff, O'Donovan, Landmesser (3) | 128 NaCl, KCl 4, 1,5 CaCl 2, 1 MgSO 4, 0,5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 glicose. |
| Goulding, Keihn (5) | 111 NaCl, KCl 3,08, 2,52 CaCl 2, MgSO 4 1,25, 1,18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 glucose |
| Brownstone (6) | 127 NaCl, KCl 1,9-3,9, 1,2 KH 2 PO 4, 2,4 CaCl 2, MgCl 2 1,3, NaHCO 3 26, 10 glucose |
| Ziskind-Conhaim Dissection (7) | 113 NaCl, KCl 3, 1 CaCl 2, 6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glucose |
| Ziskind-Conhaim Extracelular (7) | 113 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glicose. |
| O'Donovan, grão (8,9) | 139 NaCl, KCl 2,9-5, 17 de NaHCO 3, 1 MgCl 2, 3 CaCl 2, 12 glucose |
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Disclosures
CARE ANIMAL
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff é professor no Laboratório de Expressão Gênica do Instituto Salk para Estudos Biológicos e um investigador no Instituto Médico Howard Hughes. Este trabalho foi financiado pelo Christopher Reeve e Dana Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker e Mike Sullivan em Recursos Multimídia do Instituto Salk prestou assistência com a fotografia e edição.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
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- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
