Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Summary

Questa procedura mostra come utilizzare il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell di identificare rapidamente e facilmente le migliori condizioni di elettroporazione di fibroblasti embrionali di topo (MEF) o altre cellule primarie. Considerazioni per la risoluzione dei problemi vengono discussi anche nel video associato.

Abstract

E 'sempre più evidente che elettroporazione è il modo più efficace per introdurre DNA plasmidico o siRNA in cellule primarie. Il gene Pulser sistema di elettroporazione MXcell e Gene buffer di elettroporazione Pulser (Bio-Rad) sono stati specificamente sviluppati per trasfettare facilmente acidi nucleici nelle cellule dei mammiferi e di difficile trasfezione delle cellule, come le cellule primarie e staminali. Dimostreremo come eseguire un semplice esperimento per identificare rapidamente le migliori condizioni di elettroporazione. Dimostreremo come eseguire diversi campioni attraverso una serie di condizioni elettroporazione in modo che un esperimento può essere condotto al tempo stesso l'ottimizzazione viene eseguita. Mostreremo anche come condizioni ottimali identificati utilizzando piastre a 96 pozzetti elettroporazione può essere utilizzato con cuvette elettroporazione standard, facilitando il passaggio da piastre di elettroporazione ad cuvette elettroporazione, pur mantenendo la stessa efficienza elettroporazione. Nel video, si discuterà anche alcuni dei fattori chiave che possono portare al successo o al fallimento degli esperimenti di elettroporazione.

Protocol

1) Cella preparazione

1. Quando si utilizzano cellule aderenti, è necessario trypsinize e raccogliere le cellule prima di elettroporazione.
2. Per confrontare trasfezione tra il mouse quattro fibroblasti embrionali (MEF) le culture, che rappresentano tre diversi numeri passaggio, effettuare quanto segue su ogni pallone.
3. Aspirare off terreni di coltura delle cellule.
4. Aggiungi PBS per lavare le cellule.
5. Rimuovere PBS, aggiungere tripsina sufficiente a coprire le cellule, e attendere qualche minuto per permettere tripsina per staccare le cellule.
6. Controllare fiaschi con un microscopio per verificare la condizione delle cellule, smack pallone per staccare le cellule, e quindi controllare fiasco di nuovo per rendere le cellule che sono tutti staccati.
7. Aspettare ulteriore tempo e ripetere se necessario.
8. Una volta che tutte le cellule si staccano, aggiungere siero supporti contenenti per neutralizzare tripsina.
9. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga, e le celle a pellet per centrifugazione (RCF = 300 xg).
10. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un volume noto di PBS.
11. Contare le celle.
12. Trasferimento in una nuova provetta il giusto volume di sospensione cellulare di fornire il numero di cellule per gli esperimenti (avrete bisogno di 150 ml di cellule per pozzetto ad una densità di 1 x 10 ⁶ cellule / ml).
13. Centrifuga cellule.
14. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule nel volume adeguato di tampone di Gene elettroporazione Pulser per ottenere una densità cellulare di 1 x 10 ⁶ cellule / ml.
15. Aggiungere 20 mg di plasmide per mL di sospensione cellulare e mescolare delicatamente.

2) navi di setup elettroporazione ed elettroporazione

Piastra di configurazione ed elettroporazione

1. Plug camera piastra nel modulo di potenza del sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell.
2. Aggiungere 150 microlitri miscela di cellule o tampone nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti elettroporazione.
3. Mettere piastra in camera di piatto e di impulsi.
4. Rimuovere la piastra dalla camera.
5. Mescolare bene il contenuto pipettando su e giù in ciascun pozzetto.
6. Trasferire le cellule da ogni pozzetto di pre-riscaldato a tampone 12-pozzetti.
7. Toccare piatto per distribuire le cellule e metterlo in incubatrice.
8. Lasciate che le cellule recuperare per 24 ore.

Cuvette di configurazione ed elettroporazione

9. Scollegare camera piatto dal modulo di potenza del sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell e collegare il ShockPod ™ cuvetta da camera.
10. Pipettare 600 l di sospensione cellulare in una cuvetta 0,4 elettroporazione divario cm.
11. Mettere cuvetta nella camera ShockPod e fornire impulso elettrico.
12. Togliere la cuvetta da camera.
13. Mescolare il contenuto cuvetta pipettando su e giù in cuvetta.
14. Trasferire le cellule da ogni pozzetto di pre-riscaldato a tampone 12-pozzetti.
15. Toccare piatto per distribuire le cellule e metterlo in incubatrice.
16. Lasciate che le cellule recuperare per 24 ore.

3) Rappresentante Risultati

Dopo la trasfezione delle cellule e permettere loro di recuperare, analizzare l'efficienza di trasfezione qualitativamente, usando la microscopia epifluorescente, e quantitativamente, in citometria a flusso.

Cellule Figura 1. Che sono state con successo elettroporate e ora esprime il gene GFP appaiono al microscopio epifluorescente.

Figura 2. Visualizzazione delle cellule in contrasto di fase permette la visualizzazione di cellule sia transfettate e untransfected. Queste sono le cellule che sono stati esposti a l'impulso di tensione più bassa elettroporazione a 200V. Le cellule sono in gran parte confluenti a causa della elevata densità cellulare.

Figura 3. Lo stesso campo visivo in epifluorescenza mostra un numero di cellule esprimono il marcatore GFP, ma questi sono solo una piccola percentuale di cellule visibile nell'immagine precedente.

Figura 4. A 250V, il numero totale delle cellule vive visto in contrasto di fase diminuisce leggermente.

Figura 5. Sotto epifluorescenza, si può vedere che il numero di cellule che esprimono GFP è aumentato.

Figura 6. Al massimo della tensione applicata, 375V, ci sono meno cellule vive visibili.

Figura 7. Tuttavia, una grande percentuale di cellule rimanenti esprimono GFP. Quale condizione è ottimale dipende dal disegno sperimentale. In alcuni esperimenti il ​​maggior numero di cellule transfettate potrebbe essere ottimale, in altri esperimenti la transfezione più alta percentuale potrebbe essere migliore.

Siamo interessati a la percentuale di cellule che sono GFP positivo sotto ogni condizione e di come le percentuali variano con l'età delle cellule. Citometria a flusso in grado di fornire informazioni quantitative sui risultati trasfezione per ciascuna delle diverse condizioni di elettroporazione.

Figura 8. Qui la percentuale di cellule GFP positive che sono nel passaggio sono mostrati 5 celle in ciascuna delle 12 condizioni di elettroporazione. La percentuale massima di trasfezione è stata di circa l'80% sotto l'impulso di alta tensione di decadimento esponenziale, condizione 6, e 70% sotto il forte impulso di onda quadra testato, condizione 12.

Figura 9. Con le cellule superato 9 volte prima della elettroporazione, lo schema generale di transfezione percentuale è quasi identica, ma con un calo molto lieve nelle percentuali di trasfezione.

Figura 10. Visualizzati sono le percentuali di cellule GFP nel passaggio 13 celle che mostrano una marcata riduzione in percentuale rispetto alla trasfezione delle cellule più giovani. Le più alte percentuali di trasfezione sono stati circa la metà di quello che è stato ottenuto con le cellule più giovani che dimostrano l'importanza di utilizzare le cellule sane non appena possibile dopo l'isolamento.

Condizioni Elettroporazione usati per le cellule MEF trasfezione con il gene Pulser MXcell
Condizione (1-6) Impulsi di decadimento esponenziale, tutti con 350 uF, 1000ohm	Tensione (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Condizione (7-12) Onda quadra legumi, tutti con 2000 uF, 1000 ohm, e 1 impulso	Tensione (V)	Durata impulso (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Discussion

In questo articolo video viene illustrato come utilizzare il sistema di elettroporazione MXcell di identificare facilmente le condizioni ottimali per l'elettroporazione MEF o altre linee di cellule primarie. Il formato a 96 pozzetti piastra permette di replicare molte delle condizioni sperimentali o di ottimizzazione da eseguire simultaneamente, il che può eliminare la necessità per molti esperimenti separati. Mentre si esegue questa procedura, si deve ricordare di utilizzare le cellule sane non appena possibile dopo l'isolamento e ad utilizzare l'elettroporazione condizioni che sono abbinati al buffer di elettroporazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2674