Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Summary

Denna procedur visar hur du använder Gene Pulser MXcell elektroporation systemet för att snabbt och enkelt identifiera de bästa elektroporation förutsättningarna för mus embryonala fibroblaster (MEFs) eller andra primära celler. Överväganden för felsökning diskuteras också i den tillhörande video.

Abstract

Det blir allt tydligare att elektroporation är det mest effektiva sättet att införa plasmid DNA eller siRNA i primära celler. Den Gene Pulser MXcell elektroporation systemet och Gene Pulser elektroporation buffert (Bio-Rad) var särskilt utvecklat för att enkelt transfektera nukleinsyror in i däggdjursceller och svåra att transfektera celler, t.ex. primär-och stamceller. Vi kommer att visa hur du utför ett enkelt experiment för att snabbt identifiera de bästa elektroporation förhållanden. Vi kommer att visa hur man kör flera prov genom en rad elektroporation villkor så att ett experiment kan utföras samtidigt som optimering utförs. Vi kommer också att visa hur optimala förhållanden identifieras med hjälp av 96 brunnar elektroporation plattor kan användas med standard elektroporation kyvetter, underlätta övergången från elektroporation plattorna elektroporation kyvetter med bibehållen elektroporation effektivitet. I videon kommer vi att diskutera också några av de viktigaste faktorerna som kan leda till framgång eller misslyckande elektroporation experiment.

Protocol

1) cellberedningen

1. När du använder anhängare celler, är det nödvändigt att trypsinize och samla in de celler före elektroporation.
2. Att jämföra transfektion bland de fyra möss embryonala fibroblaster (MEF) kulturer, som representerar tre olika passage nummer, utföra följande på varje kolv.
3. Sug av media cellkultur.
4. Lägg PBS att tvätta celler.
5. Ta bort PBS, lägga tillräckligt med trypsin att täcka celler, och vänta några minuter så att Trypsin att lossa celler.
6. Kontrollera kolvar med ett mikroskop för att kontrollera tillståndet i cellerna, smacka kolv lösgöra celler, och kontrollera sedan kolv igen för att kontrollera cellerna alla är fristående.
7. Vänta ytterligare tid och upprepa om det behövs.
8. När alla celler är fristående, lägga serum innehållande media att neutralisera trypsin.
9. Överför celler till ett centrifugrör, och pellets celler genom centrifugering (RCF = 300 xg).
10. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i en känd volym av PBS.
11. Räkna celler.
12. Förflyttas till en ny slang rätt volym cellsuspension att ge det nödvändiga antalet celler för experiment (du behöver 150 mikroliter celler per brunn vid en densitet av 1 x 10 ⁶ celler / ml).
13. Centrifugera cellerna.
14. Avlägsna supernatanten och suspendera cellerna i lämplig volym av Gene Pulser elektroporation buffert för att uppnå en cell densitet på 1 x 10 ⁶ celler / ml.
15. Lägg till 20 mikrogram av plasmiden per ml cellsuspension och blanda försiktigt.

2) elektroporation fartyg installation och elektroporation

Plate installation och elektroporation

1. Anslut plattan kammare i strömmodulen av genen Pulser MXcell elektroporation system.
2. Pipettera 150 mikroliter celler blandning eller buffert i brunnarna i en 96-håls elektroporation plattan.
3. Sätt plåten i plåt kammare och puls.
4. Avlägsna plattan från kammaren.
5. Blanda väl innehållet genom att pipettera upp och ner i varje brunn.
6. Överför celler från varje brunn för att förvärmda buffert i 12-brunnars plattor.
7. Tryck plattan att distribuera celler och lägga den i kuvös.
8. Låt cellerna återhämta sig under 24 timmar.

Cuvette installation och elektroporation

9. Koppla tallrik kammare från strömmodulen av genen Pulser MXcell elektroporation systemet och koppla in ShockPod ™ kyvetten kammare.
10. Pipettera 600 mikroliter cellsuspension i en 0,4 cm lucka elektroporation kyvett.
11. Sätt kyvetten i ShockPod kammare och leverera elektrisk puls.
12. Avlägsna kyvetten från kammaren.
13. Blanda kyvett innehållet genom att pipettera upp och ned i kyvett.
14. Överför celler från varje brunn för att förvärmda buffert i 12-brunnars plattor.
15. Tryck plattan att distribuera celler och lägga den i kuvös.
16. Låt cellerna återhämta sig i 24 timmar.

3) representativa resultat

Efter transfecting celler och ger dem möjlighet att återhämta sig, analysera transfektion effektivitet kvalitativt, med hjälp epifluorescent mikroskopi, och kvantitativt med hjälp av flödescytometri.

Figur 1. Celler som har framgångsrikt electroporated och nu uttrycker GFP-genen visas under epifluorescent mikroskopi.

Figur 2. Titta på cellerna i faskontrast tillåter visualisering av både transfekterade och untransfected celler. Dessa är de celler som utsätts för den lägsta spänningen elektroporation pulsen på 200V. Cellerna är till stor del konfluenta grund av den höga celltätheten.

Figur 3. Samma synfält i epifluorescence visar ett antal celler som uttrycker GFP markör, men dessa är endast en liten andel av cellerna som syns i föregående bild.

Figur 4. Vid 250V, minskar det totala antalet levande celler ses under faskontrast något.

Figur 5. Under epifluorescence kan man se att antalet GFP-innehållande celler har ökat.

Figur 6. På den högsta spänning, 375V, finns det färre levande celler synliga.

Figur 7. Men en stor andel av de kvarvarande celler som uttrycker GFP. Vilka villkor är optimalt beror på experimentell design. I vissa experiment flest transfekterade celler kan vara optimal, i andra experiment den högsta andelen transfektion kan vara bäst.

Vi är intresserade av den andel av celler som är GFP positivt under varje tillstånd och hur de procentsatser varierar med cellens ålder. Flödescytometri kan ge kvantitativ information om transfektion resultaten under varje av de olika elektroporation förhållanden.

Figur 8. Här andel av celler som är GFP positiva i passagen 5 cellerna under varje av de 12 elektroporation villkor visas. Den maximala transfektion andel var cirka 80% under den högsta spänningen exponentiellt avtagande puls, villkor 6, och 70% under starkaste fyrkantvåg puls testas, villkor 12.

Figur 9. Med cellerna passerade 9 gånger före elektroporation är det övergripande mönstret av transfektion andel nästan identiska, men med en mycket liten minskning av transfektion procentsatser.

Figur 10. Här visas de procentsatser av GFP celler i passagen 13 celler som visar en markant minskning av transfektion procent i förhållande till de yngre cellerna. Den högsta transfektion andel var ungefär hälften vad som uppnåtts med de yngre cellerna visar vikten av att använda friska celler, så snart efter isoleringen som möjligt.

Elektroporation Villkor för transfecting MEF celler med Gene Pulser MXcell
Condition (1-6) Exponentiellt avtagande pulser, alla med 350 UF, 1000ohm	Spänning (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Skick (7-12) Fyrkantsvåg pulser, alla med 2000 uF, 1000 ohm och 1 puls	Spänning (V)	Puls Varaktighet (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Discussion

Denna video artikeln demonstrerar hur du använder MXcell elektroporation systemet för att enkelt identifiera optimala elektroporation förutsättningar för MEFs eller i andra obearbetade cellinjer. Den 96-brunnar format kan för många replikat av experimentella eller optimering villkor som ska utföras samtidigt, vilket kan eliminera behovet av många olika experiment. Även om de genomför detta förfarande, bör man komma ihåg att använda friska celler, så snart efter isoleringen som möjligt och att använda elektroporation villkor som är anpassade till elektroporation buffert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2674