قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

Summary

الإلتقام ينظم ينظم مستويات التعبير سطح الخلية لمعظم البروتينات الغشاء. هنا نستخدم اختزال والكواشف غشاء biotinylation impermeant لقياس معدل التقامي للنقل الدوبامين (DAT) ، وهو بروتين الغشاء polytopic. الأسلوب يسهل نهج مباشرة لقياس معدل التقامي معظم البروتينات غشاء البلازما.

Abstract

بروتينات غشاء البلازما هي كبيرة ، مجموعة متنوعة من البروتينات تتكون من المستقبلات ، وقنوات ايون وشركات النقل والمضخات. نشاط هذه البروتينات هي المسؤولة عن مجموعة متنوعة من الأحداث الخلوية الأساسية ، بما في ذلك تسليم المواد الغذائية ، واستثارة الخلوية ، وإشارات كيميائية. ويتم تنظيم العديد من البروتينات بشكل حيوي غشاء البلازما من الاتجار التقامي ، الذي ينظم وظيفة البروتين البروتين التعبير عن طريق تغيير السطح. الآليات التي تسهل الإلتقام البروتين معقدة وغير مفهومة تماما عن بروتينات غشاء كثيرة. لكي نفهم تماما الآليات التي تتحكم في الاتجار التقامي من بروتين معين ، فمن الأهمية بمكان أن يتم قياسها بدقة نسبة البروتين التقامي ق. لمستقبلات عديدة ، كثيرا ما يتم تحقيق معدل القياسات المباشرة التقامي باستخدام مستقبلات يغاندس المسمى. ومع ذلك ، لفئات كثيرة من البروتينات الغشاء ، مثل النقل ، ومضخات وقنوات أيون ، ليس هناك يجند مريحة والتي يمكن استخدامها لقياس معدل التقامي. في هذا التقرير ، ونحن تصف طريقة biotinylation عكسها التي نستخدمها لقياس نقل الدوبامين (DAT) معدل التقامي. هذا الأسلوب يوفر نهجا واضحة لقياس معدلات الاستيعاب ، ويمكن استخدامها بسهولة لدراسات الاتجار معظم البروتينات الغشاء.

Protocol

إجراء لمحة عامة :

باستخدام هذا النهج ، وصفت تساهميا بروتينات سطح الخلية مع البيوتين على بقايا يسين المتاحة خارج الخلية باستخدام impermeant الغشاء ، ثاني كبريتيد ، بالإضافة كاشف biotinylation (سلفو - NHS - SS - البيوتين) تحت شروط تقييدية الاتجار (أي درجة حرارة منخفضة) (انظر الشكل 1 من أجل التوضيح). هو تحول مجموعة واحدة من الخلايا لشروط متساهلة الاتجار (37 درجة مئوية) واستيعاب البروتينات biotinylated. تبقى مجموعة أخرى من الخلايا في درجة حرارة منخفضة تصل إلى ضوابط ل1) سطح البروتين الكلي في الوقت = 0 ، و 2) السيطرة تجريد. بعد فترة قصيرة من استيعاب ، وتحول الخلايا مرة أخرى إلى درجة حرارة منخفضة لوقف استيعاب ، وتجريد أي البيوتين سطح المتبقية قبالة عن طريق علاج الخلايا مع وكيل الحد ، والتي يشق على البيوتين ، بالإضافة ثاني كبريتيد. محمية Biotinylated البروتينات التي نشأت من سطح الخلية والمنضوية تم تجريد من الخطوة ، وسوف يكون فقط biotinylated البروتينات التي لا تزال قائمة. بعد انحلال الخلايا ، يتم عزل البروتينات التي biotinylated streptavidin تقارب اللوني ويتم الكشف عن بروتين الاهتمام من جانب immunoblotting الكمي. لتحديد معدل التقامي ، تتم مقارنة كمية البروتين المنضوية لمراقبة سطح مجموع المسمى في الوقت = 0. وقد استخدمنا هذا النهج بنجاح لقياس معدل استيعاب لبافراز الدوبامين العصبية ⁽¹⁾ ونقل ^1-4.

مفصل البروتوكول :

اليوم 1 :

1. لوحة الخلايا في 6 لوحات من هذا القبيل جيدا أنها لن تكون متكدسة ~ 80 ٪ في يوم 2. بدلا من ذلك ، إذا كنت تستخدم الخلايا transfected ، transfect في الكثافة بحيث أنها سوف تكون متكدسة ~ 80 ٪ في ذلك الوقت وسوف يقاس معدل الاستيعاب. إذا الخلايا ليست ملتصقة بقوة ، ينبغي أن يعامل النسيج وير الثقافة مع خلية التصاق الركيزة (مثل بولي - D - يسين) لمنع فقدان الخلية أثناء الخطوات يغسل واسعة النطاق.
2. ليجري اختبار كل من البروتين ، لاستخدامها لوحة 2 الآبار على واحد مثل لوحة سطح البروتين الكلي (T = 0) والضوابط تجريد. على طبق من الثانية ، لوحة بئر واحدة لكل شرط استيعاب يجري اختبارها (أي معدل التقامي القاعدية مقابل المخدرات المعاملة).
3. إعداد الحلول التالية وتخزينها في درجات الحرارة وأشارت لاستخدامها في يوم 2 :
   • PBS ^{2 +} : الفوسفات مخزنة المالحة (الرقم الهيدروجيني 7.4) تستكمل مع 1.5 ملم MgCl ₂ ، 0.2 ملم CaCl ₂ ، (4 درجات مئوية)
   • Biotinylation ارو الحل : ^{2 +} PBS تستكمل مع جليكاين 100 ملم ، (4 درجات مئوية)
   • NT العازلة : 150 مم كلوريد الصوديوم ، EDTA 1.0 ملم ، 0.2 ٪ BSA ، 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.6 (4 درجات مئوية)
   • RIPA العازلة : 10 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، EDTA 1.0 ملم ، 0.1 ٪ SDS ، 1.0 ٪ تريتون X 100 ، 1.0 ٪ deoxycholate الصوديوم (4 درجات مئوية)
   • سلفو - NHS - SS - البيوتين حل المخزون : تذوب في dimethylsulfoxide (DMSO) إلى 200 ملغم / لتر ، (-20 درجة مئوية)
   • تريس هيدروكلوريد الفوسفين (2 - Carboxyethyl) (TCEP) حل الأسهم : 500 ملم في H ₂ O ، (-20 درجة مئوية ، وغطت في احباط لحجب الضوء)

يوم 2 :

1. إعداد برنامج تلفزيوني ^{2 +} تستكمل مع الجلوكوز 0.18g/ml ، 0.2 ٪ مفتش / البروتيني خالية من ألبومين المصل البقري (PBS ^{2 +} / ز / BSA). دافئ قبل هذا الحل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
2. ذوبان الجليد من محلول المخزون سلفو - NHS - SS - البيوتين في أعلى المقعد لإذابة DMSO. مباشرة قبل استخدامها ، وإعداد الطازجة سلفو - NHS - SS - البيوتين الحل (2.5 ملغ / مل في الجليد الباردة PBS ^{2 +} ، مما يكفي ل0.75 مل / جيد). دوامة الحل بقوة لsolubilize في DMSO. علما بأن كاشف NHS - البيوتين محملئا بسهولة في محلول مائي. ولذلك ، ينبغي إعداد كل الحلول مباشرة قبل الاستعمال.
3. Biotinylation : لوحات على مكان حمام الجليد في غرفة باردة وشطف 3 × 2 مل مع الثلج الباردة PBS ^{2 +.} تكون على يقين من أن لوحات الزاوية قليلا للسماح لتصريف المياه وإزالة كاملة من الحل العازلة. إضافة 0.75 مل / جيد من الحل سلفو - NHS - SS - البيوتين جديدة لكل بئر. احتضان × 15 ، 4 درجات مئوية على حمام الجليد مع اهتزاز قوي. بعد اكتمال الحضانة ، وإعداد أخرى جديدة سلفو - NHS - SS - البيوتين الحل. حل محل القديم مع الحل الطازجة واحتضان س '15 ، 4 درجات مئوية.
4. تروي : ومن الأهمية بمكان أن يتم تطفئ كل رد فعل غير NHS - البيوتين الجزيئات ، بحيث أنها لن تتفاعل مع البروتينات داخل الخلايا وbiotinylate بمجرد lysed الخلايا. غسل الخلايا 3 × 2 مل مع الحل تسقية واحتضان مرتين في 2 مل حل يشفي × 15 ، 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
5. داخليا : إذا كان يجري اختبار علاجات دوائية ، إضافة إلى تركيز الدواء المناسب PBS ^{2 +} / ز / جيش صرب البوسنة. إبقاء لوحة التحكم في درجة مئوية (4) وجلب صفيحة الداخلي للخروج من الغرفة الباردة. تغسل 3 × 2 مل مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت ^{2 +} / ز / جيش صرب البوسنة (+ / -- د.UGS) ويترك في نفس الحلول (2 مل / جيد). ملء أي آبار فارغة مع مرحلة ما قبل حل تحسنت لضمان درجة الحرارة حتى عبر لوحة. نقل الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10. مباشرة قبل نهاية الحضانة 37 درجة مئوية ، وإعداد الطازجة حل TCEP 50 ملم في المخزن NT لاستخدامها في خطوة تجريد وتخزينها على الجليد. إعداد كمية تكفي ل1.0 مل / أيضا.
6. تجريد : لوحة وعلى الفور نقل (ق) للحمام الجليد والعودة إلى غرفة باردة. غسل الخلايا بسرعة مع Windows NT العازلة الجليد الباردة ، 3 × 2 مل لوقف الإلتقام. غسل أيضا مراقبة الشريط الآبار 3 × 2 مل مع العازلة NT. إضافة 1.0 مل حل جديد لتجريد كل بئر. احتضان على الجليد ، 15 ، 4 درجات مئوية مع الهز لطيف. استبدال الآبار مع الحل تجريد الطازجة واحتضان إضافي 15 '، و 4 درجات مئوية على الجليد.
7. تحلل : اغسل جميع الآبار التي تعرضت للنهب حل ، 3 × 2 مل NT العازلة. ثم تغسل جميع الآبار (بما في ذلك الضوابط الكلية) مع 3 × ² 2 PBS مل ^+. ليز في 300μl/well RIPA العازلة (أو غيرها من العازلة التي تتلاءم مع تحلل البروتين من الفائدة) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني الطازجة (1.0 ملم PMSF ، 1.0 ميكروغرام / مل كل leupeptin ، وأبروتينين pepstatin). ليز التي تهز × 20 ، 4 درجات مئوية. لأنابيب نقل microfuge والحطام الخلوية واضح من جانب الطرد المركزي XG 18000 ، 10 ، 4 درجات مئوية.
8. تركيز بروتين تقرير : استخدام البروتين مقايسة متوافقة مع الظروف تحلل الخاص (مثل فحص البروتين العاصمة ، بيو راد) لتحديد تركيز البروتين من lysates بالمقارنة مع منحنى BSA القياسية.
9. Streptavidin التقارب اللوني : إعداد أنابيب microfuge مع كميات مكافئة من البروتين لكل عينة. إضافة العازلة تحلل ليصل حجم النهائي لكل عينة ل200μl. دوامة من الخرز agarose streptavidin بقوة لوضع تعليق حتى. باستخدام pipettor 200μl مع طرف قطع والخرز ماصة في كل أنبوب. أوصت 20μl lysate beads/50 ميكروغرام. يحضن بين عشية وضحاها ، 4 درجات مئوية على محور دوار الأنبوب.

يوم 3 :

1. حبة الغسيل : عينات من أجهزة الطرد المركزي ، 18000 XG ، 2 'لجمع الخرز. نضح قبالة lysate ، والحرص على عدم الاقتراب من حبة بيليه مع الشافطة. استخدام غيض ماصة بلاستيكية على نهاية الشافطة للتحكم بشكل أفضل. إضافة 0.75 مل العازلة تحلل كل أنبوب ، ودوامة لغسل الخرز. عينات من أجهزة الطرد المركزي ، 18000 XG ، 2 'لجمع الخرز والطموح وتكرار الغسيل مرتين (ثلاث غسلات في المجموع). بعد غسل النهائي ، نضح قدر من العازلة ممكن من دون إزعاج بيليه حبة. البقشيش الأنبوب نحو الشافطة يساعد في هذه الخطوة.
2. شطف العينة : إضافة 20 25μl عينة Laemmli 2X العازلة (الحد) لكل أنبوب. وكيل وسوف يلتصق خفض السندات ثاني كبريتيد NHS - SS - البيوتين ، والإفراج عن البروتينات المعزولة في الحل. معظم البروتينات الغشاء عرضة لتجميع عند المغلي ، وينبغي ألا يكون ساخنا قبل تحميلها على المواد الهلامية للSDS - PAGE. تحديد حساسية للحرارة من البروتين الخاص بك من الفائدة قبل إجراء هذه التجارب. إذا كان البروتين لا يمكن ان تتسامح التدفئة الغليان / ، على احتضان المدورة ، 30 '، ودرجة حرارة الغرفة قبل تحليل بواسطة SDS - PAGE. هذه هي كافية ليلتصق ثاني كبريتيد السندات وأزل البروتينات.
3. SDS - PAGE وimmunoblotting : البروتينات منفصلة بواسطة SDS - PAGE. لكل عينة ، فمن الأسهل لتشغيل العينات وفقا للترتيب التالي : السطح الكلي (الوقت = 0) ، قطاع غزة ، شرط استيعاب # 1 ، الحالة رقم 2 ، وما إلى ذلك نقل إلى الغشاء عن وصمة عار immunoblotting مع الأجسام المضادة المناسبة لبروتين الخاص من الفائدة. القبض على عصابات مناعيا باستخدام وثائق اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا هلام النظام ، موقنا أنه لا توجد خلية المشبعة. قياس كثافة الموجات باستخدام كل هلام التحليل / كثافة البرامج.

ممثل النتائج :

ويرد نتيجة طخة مناعية ممثل في الشكل 2A. أقوى إشارة في حارة "الكل" (T) ، وهو المبلغ الإجمالي للبروتين السطح الداخلي قبل. ينبغي أن "الشريط" السيطرة (S) من الناحية المثالية على مقربة من فارغة ، مما يدل على أن القطاع على درجة من الكفاءة للتجربة. ويتم احتساب كفاءة قطاع بمقارنة كثافة حارة "الشريط" الى ان من حارة "الكل" (مثل البروتين الذي biotinylated بالتوازي مع قطاع غزة ، ولكن ليس إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية ولا يتعرضون للتجريد الحل). يتم استخدام الصيغة التالية :

[1 -- (شريط / المجموع)] * 100 ٪

باستخدام هذه الصيغة ، وكان الشريط في الشكل 2 99.8 ٪ فعالة. أخيرا ، سوف ترى عصابات أقل كثافة من المجموع في الممر الداخلي (ق) (I). 'تم قياس معدلات نقل الداخلي واستيعاب الدوبامين عن 10' في المثال (الشكل 2) ، وعولج الخلايا المعالجة إما مع مركبة أو 1μM خلات myristate phorbol (PMA) خلال الفترة من 10 تدخيل الأولي. ويتم احتساب معدل استيعاب مايلي :

المنضوية / مجموع * 100

كما رأينا في الشكل 2B ، 10.4 ٪ DAT سطح المنضوية أكثر من 10 'تحت سيارة المعاملة شروطه. زيادة معدلات استيعاب PMA العلاج DAT إلى 23.2 ٪ من إجمالي مساحة DAT.

الشكل 1. وbiotinylated بروتوكول التوضيح. خلايا في 4 درجات مئوية فقط لتسمية السكان السطح ، وتحولت إلى 37 درجة مئوية إلى الشروع في استيعاب. بعد استيعاب ، والمبردة بسرعة لوقف عمليات الخلايا التقامي المتبقية والبيوتين السطح هو تجريده من خلال معالجة الخلايا مع وكيل الحد. البروتينات فقط biotinylated التي تبقى هي تلك التي نشأت من السطح في ر = 0 والمنضوية كانت ، الأمر الذي يحميهم من العلاج تجريد. يتم عزل البروتينات التي Biotinylated دفعة اللوني تقارب مع حبات streptavidin ويتم الكشف عن بروتين الاهتمام من جانب immunoblotting.

الشكل 2. PKC التنشيط يزيد من معدل DAT التقامي. مقايسة التطبع. وأعرب عن الخلايا PC12 biotinylated ستابلي DAT ، 4 درجات مئوية كما هو موضح في "بروتوكول مفصلة". وقد تحسنت بسرعة الخلايا إلى 37 درجة مئوية ± 1 ميكرومتر سلطة النقد الفلسطينية وحضنت '10 و 37 درجة مئوية. جردت البيوتين المتبقية عن طريق خفض ، وlysed الخلايا والبروتينات biotinylated كانت معزولة من قبل streptavidin التقارب اللوني. (أ) الممثل طخة مناعية تظهر السطح في مجموع DAT ر = 0 (T) وقطاع التحكم (S) ، والمنضوية DAT (I) في ظل الظروف المشار اليها. (ب) تم القبض على عصابات مع كاميرا CCD وكميا مع الكمية البيانات البرمجيات (بيو راد). يتم التعبير عن البيانات و٪ مين مجموع internalized/10 DAT.

الشكل 3. طخة مناعية سبيل المثال يصور الشريط البيوتين الفقراء. مقايسة التطبع. وأعرب عن الخلايا PC12 biotinylated ستابلي DAT ، 4 درجات مئوية كما هو موضح في "بروتوكول مفصلة". وقد تحسنت بسرعة الخلايا إلى 37 درجة مئوية ، وحضنت '10 و 37 درجة مئوية. جردت البيوتين المتبقية عن طريق خفض ، وlysed الخلايا والبروتينات biotinylated كانت معزولة من قبل streptavidin التقارب اللوني. لطخة مناعية يظهر السطح في مجموع DAT ر = 0 (T) وقطاع التحكم (S) ، والمنضوية DAT (I). علما الفرقة واضحة في الشريط حارة السيطرة ، مما يدل على كفاءة القطاع الفقير.

Discussion

المشاكل الشائعة : المشكلة الأكثر شيوعا التي تنشأ في هذه التجارب هو ضعف كفاءة القطاع. كفاءة قطاع حاسم في أن تكون قادرة على تفسير النتائج. إلا إذا كان الشريط كفاءة عالية ، فإنه ليس من الممكن أن نستنتج أن أي البروتينات biotinylated في الممرات استيعاب كانت ، في الواقع ، المنضوية من السطح. شرائط الكفاءة ≥ 90 ٪ هي الأمثل ، ونحن تجاهل أي نتائج إذا كان الشريط يندرج تحت هذا المستوى. ويرد مثال على الشريط الفقراء في الشكل 3. علما أن الفرقة في حارة الشريط غير واضح تماما ، ويناظر كفاءة القطاع من 34 ٪. إذا كفاءات قطاع الفقراء قد يحدث ، وليس TCEP الطازجة بذلت على الفور قبل إضافة إلى الخلايا. بدلا من ذلك ، قد يكون TCEP المتدهورة وكاشف الجديدة سوف يتعين شراؤها. استخدام مسحوق TCEP ، بدلا من الحل ، قد تحايل على هذه المشكلة.

التعديلات الممكنة : في التقرير الحالي ، ونحن يقاس معدل استيعاب DAT النسبية ، التي اتخذت على مدار الدقائق ال 10 الأولى من استيعاب ، ومقارنة ذلك مع معدل استيعاب DAT خلال تفعيل PKC. بدلا من ذلك ، يمكن قياس معدل ارتفاع درجة حرارة مطلقة من قبل الخلايا لزيادة نقاط الوقت. في حين أن هذا قد يكون ممكنا ، فإن تجربتنا تشير إلى أن المستويات المنخفضة في إشارة مبكرة الوقت نقطة ، إلى جانب أمور تجريبية تقلباته ، لا تسفر عن نتائج استنساخه للغاية في وقت مبكر جدا نقاط. أيضا ، على الرغم من أننا تستخدم الخلايا الملتصقة ، ويمكن تعديل مقايسة لتعليق الخلية. ويمكن أيضا تعليق الأنسجة ، مثل synaptosomes ، يمكن استخدامها. ومع ذلك ، فمن الضروري أن يتم تأسيس أول سلامة الأغشية. إذا كان التحضير له نسبة كبيرة من الأغشية "تسرب" ، فإن كاشف البروتينات داخل الخلايا biotinylation التسمية وأنه لن يكون من الممكن تحديد سعر موثوق التقامي. في هذه الحالة ، ينبغي أيضا أن تكون immunoblots بحث للحصول على البروتين داخل الخلايا علامة ، مثل الأكتين ، لاختبار ما اذا كان يتعرض تجمع البروتينات داخل الخلايا إلى كاشف biotinylation.