Измерение плазматической мембраны Белки Endocytic Цены на Реверсивные биотинилирование

Summary

Регулируемые эндоцитоза управляет клеточной поверхности уровня экспрессии большинства мембранных белков. Здесь мы используем приводимым, мембраны impermeant реагентов биотинилирование для измерения скорости endocytic переносчика дофамина (DAT), polytopic белков мембраны. Метод обеспечивает прямой подход к измерению endocytic скорость большинства белков плазматической мембраны.

Abstract

Плазменные белки мембраны большая, разнообразная группа белков входят рецепторы, ионные каналы, транспортеры и насосы. Активность этих белков отвечает за целому ряду ключевых клеточных событий, включая доставку питательных веществ, клеточной возбудимости, и химических сигналов. Многие мембранные белки плазмы динамически регулируется endocytic торговлей людьми, который модулирует функции белка путем изменения экспрессии белка поверхности. Механизмы, обеспечивающие белка эндоцитоза, сложны и не до конца понимали многие мембранные белки. Для того чтобы полностью понять механизмы, которые управляют endocytic оборота данного белка, очень важно, чтобы скорость endocytic белка с точно измерена. Для многих рецепторов, прямые измерения скорости endocytic часто достигнуто использованием меченых лигандов рецепторов. Тем не менее, для многих классов мембранных белков, таких как транспортеры, насосы и ионные каналы, нет удобного лигандов, которые могут быть использованы для измерения endocytic ставки. В настоящем докладе мы опишем метод обратимой биотинилирование, что мы используем для измерения переносчика дофамина (DAT) endocytic ставки. Этот метод обеспечивает прямой подход к измерению интернализации ставки, и могут быть легко использованы для торговли исследования большинства белков мембраны.

Protocol

Описание процедуры:

Используя этот подход, белков клеточной поверхности, которые ковалентно меченные биотином По имеющейся внеклеточной остатков лизина использованием мембраны impermeant, дисульфид-связанных биотинилирование реагента (сульфо-NHS-SS-биотин), при торговле ограничительных условий (например, низкая температура) (см. рис 1. Для иллюстрации). Один комплект клетки смещено к торговле людьми разрешительных условий (37 ° С) и биотинилированного белков усвоить. Другой набор клеток сохраняются при низкой температуре, в качестве контроля для: 1) общий белок поверхности в момент = 0, и 2) зачистки контроля. После короткого периода интернализации, клетки смещаются обратно к низкой температуре, чтобы остановить интернализации, и любой остаточной биотин поверхности отгоняют при обработке клеток с восстановителем, который расщепляет дисульфидные связи биотин. Биотинилированные белки, которые возникли из клеточной поверхности и были внутренним защищены от зачистки шаг, и будет только биотинилированного белки, которые остаются. После лизиса клеток, биотинилированного белки выделяли стрептавидин аффинной хроматографии и белок обнаруживается количественная иммуноблоттинга. Чтобы определить, endocytic ставка, сумма интернализованных белка по сравнению с тотальным контролем поверхности помечены в момент = 0. Мы успешно использовали этот подход для измерения скорости интернализации нейронов норадреналина и дофамина ^{1 1-4} перевозчиков.

Подробная Протокола:

День 1:

1. Пластина клеток в 6 луночных, что они будут ~ 80% сливающийся в День 2. Или же, если трансфекции клетки используются, трансфекции при плотности такое, что они будут ~ 80% сливающийся в то время интернализации скорость будет измеряться. Если клетки не сильно единомышленником, посуда культуры тканей следует относиться с подложки клеточной адгезии (например, поли-D-лизин), чтобы предотвратить потерю клеток при обширных шаги стирки.
2. Для каждого белка проходит испытания, пластины 2 скважин на одной пластине, которые будут использоваться в качестве общего белка поверхности (г = 0) и зачистки управления. На второй пластине, пластина одной скважины для каждого интернализации условиях проходит испытания (например, базальные endocytic ставка против наркотиков обработанных).
3. Подготовьте следующие решения и хранить при указанных температурах для использования на 2-й день:
   • PBS ^{2 +:} фосфатным буферным раствором (рН 7,4) с добавлением 1,5 мМ MgCl _2, 0,2 мМ CaCl _2, (4 ° С)
   • Биотинилирование Quench Решение: PBS ^{2 +} дополнена 100 мМ глицин, (4 ° С)
   • NT буфера: 150 мМ NaCl, 1,0 мМ ЭДТА, 0,2% БСА, 20 мМ Трис, рН 8,6, (4 ° С)
   • RIPA буфера: 10 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1,0 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 1,0% Triton X 100, 1,0% натрия дезоксихолата, (4 ° С)
   • Сульфо-NHS-SS-биотин маточный раствор: Растворить в диметилсульфоксид (ДМСО) до 200 мг / мл, (-20 ° С)
   • Трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид (TCEP) исходного раствора: 500 мм H ₂ O, (-20 ° C, покрытый фольгой, чтобы блокировать свет)

День 2:

1. Подготовка PBS ^{2 +} дополнена 0.18g/ml глюкозы, 0,2% IgG / протеазы без бычьего сывороточного альбумина (PBS ^{2 +} / г / BSA). Предварительно это решение теплой до 37 ° С на водяной бане.
2. Оттепель из сульфо-NHS-SS-биотин маточного раствора на скамье сверху расплава ДМСО. Непосредственно перед применением, готовить свежий сульфо-NHS-SS-биотин раствор (2,5 мг / мл в ледяной PBS ^{2 +,} достаточных для 0,75 мл / лунку). Vortex решение энергично, чтобы растворить ДМСО. Обратите внимание, что NHS-биотин реагент легко гидролизуется в водном растворе. Таким образом, все решения должны быть подготовлены непосредственно перед использованием.
3. Биотинилирование: Место пластин на ледяной бане в холодной комнате и промыть 3 х 2 мл с ледяным PBS ^{2 +.} Будьте уверены, что пластины под небольшим углом, чтобы обеспечить полный дренаж и удаление буферного раствора. Добавить 0,75 мл / лунку свежий сульфо-NHS-SS-биотин раствора в каждую лунку. Инкубируйте х 15 ', 4 ° С на ледяной бане при энергичном встряхивании. После инкубации завершена, подготовить еще один свежий сульфо-NHS-SS-биотин решение. Замените старый раствор свежий раствор и инкубировать х 15 ', 4 ° C.
4. Тушение: Очень важно, чтобы все не реагирует NHS-биотином молекулы закаленных, так что они не будут вступать в реакцию с biotinylate и внутриклеточных белков раз клетки лизируются. Вымойте клетки 3 х 2 мл с тушением раствора и инкубировать в два раза в 2 мл утолить решение х 15 ', 4 ° С с осторожном встряхивании.
5. Интернализация: Если медикаментозное лечение проходят испытания, добавьте соответствующей концентрации препарата PBS ^{2 +} / г / BSA. Контролируйте пластины при температуре 4 ° С и довести интернализации пластину из холодной комнате. Вымойте 3 х 2 мл подогретого PBS ^{2 +} / г / BSA (+ / - д-рПХГ) и оставить в те же решения (2 мл / лунку). Заполнить пустые скважины с подогретого решением для обеспечения равномерного распределения температуры по всей пластине. Передача клетки 37 ° C инкубатора для 10 '. Непосредственно перед концу 37 ° С инкубационный, готовить свежий 50 мМ TCEP решение в буфер NT, которые будут использоваться для снятия шаг и хранить на льду. Подготовка достаточное количество для 1,0 мл / лунку.
6. Зачистка: немедленно перевести пластины (ей) ледяной бане и вернуться в холодном помещении. Быстро мыть клетки с ледяной NT буфер, 3 х 2 мл, чтобы остановить эндоцитоза. Также мыть полосе контроля скважин 3 х 2 мл буфера NT. Добавить 1,0 мл свежей зачистки раствора в каждую лунку. Инкубировать на льду, 15 ', 4 ° С с осторожном встряхивании. Замените скважин со свежими зачистки раствора и инкубировать еще 15 ', 4 ° C на льду.
7. Лизис: Вымойте все колодцы, которые подвергались зачистки раствора, 3 х 2 мл NT буфера. Затем промыть все лунки (в том числе общего управления) с 3 по 2 мл PBS ^{2 +.} Lyse в 300μl/well RIPA буфера (или другого буфера для лизиса совместимы для белок), содержащие свежие ингибиторов протеазы (1,0 ммоль PMSF, 1,0 мкг / мл leupeptin, апротинин и пепстатина). Lyse путем встряхивания х 20 ', 4 ° C. Трансфер в микроцентрифужную труб и ясно распада клеток путем центрифугирования 18000 мкг, 10 ', 4 ° C.
8. Определение концентрации белка: Используйте белка анализа совместима с вашей лизис условиях (например, постоянного анализа белка, Bio-Rad) для определения концентрации белка лизатов по сравнению со стандартной кривой BSA.
9. Стрептавидином аффинной хроматографии: Подготовка микроцентрифужную трубы с эквивалентным количеством белка для каждого образца. Добавить лизис буфера принести окончательный объем каждого образца 200 мкл. Vortex стрептавидин агарозном бисером активно привлекать к даже подвеску. Использование 200 мкл пипетки с наконечником отрезаны, пипетки бисером в каждую пробирку. Рекомендуемая 20 мкл beads/50 мкг лизат. Инкубируйте ночь, 4 ° С на трубке ротатора.

День 3:

1. Бусы моющие: Центрифуга образцы, 18000 мкг, 2 'собирать бусы. Аспирируйте от лизат, стараясь не приближаться шарик шарик с аспиратором. Используйте пластиковым наконечником пипетки на конце аспиратор для лучшего контроля. Добавить 0,75 мл лизирующего буфера в каждую пробирку, и вихрь мыть шарики. Центрифуга образцы, 18000 мкг, 2 'собирать бусы и стремление повторить и мытье в два раза (три моется в общей сложности). После последней промывки, аспирация, поскольку значительная часть буфера возможно, не нарушая бусинка гранул. Чаевые трубки к аспиратор помогает с этим шагом.
2. Пример элюирования: Добавить 25 мкл 20-2x Laemmli образца буфера (уменьшение) в каждую пробирку. Восстановителя будет расщеплять NHS-SS-биотин дисульфидные связи, освобождая изолированных белков в растворе. Большинство мембранных белков являются весьма уязвимыми к агрегации при варке, и не должна быть нагрета до погрузки на гели для SDS-PAGE. Определите тепла чувствительности ваших белок до выполнения этих экспериментов. Если белка не может терпеть кипения / отопление, инкубировать на ротатор, 30 ', комнатной температуры перед анализом на SDS-PAGE. Этого достаточно, чтобы расщеплять дисульфидные связи и элюции белков.
3. SDS-PAGE и иммуноблоттинг: Отдельная белков SDS-PAGE. Для каждого образца, проще всего запустить образцов в следующем порядке: общая площадь (время = 0), полоса, интернализации состояние # 1, Состояние # 2 и т.д. Переход на мембраны для иммуноблоттинга и промокните с соответствующими антителами для белок интересов. Захват иммунореактивного диапазонах CCD-камеры гель документации система, будучи уверен, что Есть нет насыщенных пикселей. Количественная каждого диапазона плотности с помощью геля анализ / денситометрии программного обеспечения.

Представитель Результаты:

Репрезентативный результат иммуноблоттинга показано на рисунке 2А. Сильный сигнал находится в "общем" переулок (T), которая является общей сумме поверхностного белка до интернализации. "Полоса" управления (S) в идеале должна быть близкой к пустым, который демонстрирует, что полоса была эффективной для эксперимента. Полосы эффективность рассчитывается путем сравнения плотности "полоса" полосу, что и "общего" переулок (например, белок, который был биотинилированного параллельно полосе, но не было ни нагревают до 37 ° С и не подвергаться зачистки раствора). Используется следующая формула:

[1 - (полоса / всего)] * 100%

Используя эту формулу, полосы на рисунке 2, составляла 99,8% эффективнее. Наконец, вы увидите полосы меньшей интенсивностью, чем в общей интернализации переулок (ов) (I). В примере (рис. 2), клетки, обработанные обрабатывали либо транспортное средство или 1 мкм форбол миристат ацетат (PMA) в течение 10 'интернализации и допамина ставки транспортер интернализации были измерены для 10' начальный период интернализации. Интернализации курс рассчитывается какследующим образом:

внутреннее / всего * 100

Как видно на рисунке 2B, 10.4% поверхности DAT внутренним более 10 "под автомобиль обработанных условиях. PMA лечение более высокие показатели DAT интернализации до 23,2% от общего числа DAT поверхности.

Рисунок 1. Протокол иллюстрации. Клетки биотинилированного при 4 ° С до исключительно этикетки поверхности населения, а сдвинуты до 37 ° С до начала интернализации. После интернализации, клетки быстро охлажденная, чтобы остановить endocytic процессов и остаточной биотин поверхности удаляется при обработке клеток с восстановителем. Биотинилированного только белки, которые остаются те, которые возникли из поверхности при т = 0, и было внутреннее, тем самым защищая их от зачистки лечения. Биотинилированные белки выделяли партии аффинной хроматографии с бисером стрептавидином и белок обнаруживается иммуноблоттинга.

Рисунок 2. PKC активации увеличивает DAT endocytic ставки. Интернализация анализа. PC12 клетках стабильно выражения DAT были биотинилированного, 4 ° С, как описано в разделе "Подробная протокола". Клетки быстро нагревают до 37 ° C ± 1 мкм PMA и инкубировали 10 ', 37 ° C. Остаточная биотин был лишен за счет сокращения, клетки лизировали и биотинилированного белки были выделены стрептавидин аффинной хроматографии. () Представитель иммуноблота отражает суммарный DAT поверхности при т = 0 (Т), полоса контроля (S), и внутреннее DAT (I) при указанных условиях. (В) Группы были захвачены с ПЗС-камерой и количественно с Количество данных программного обеспечения (Bio-Rad). Данные представлены в виде% от общего мин DAT internalized/10.

Рисунок 3. Пример иммуноблота изображающие плохой полосы биотин. Интернализация анализа. PC12 клетках стабильно выражения DAT были биотинилированного, 4 ° С, как описано в разделе "Подробная протокола". Клетки быстро нагревают до 37 ° С и инкубировали 10 ', 37 ° C. Остаточная биотин был лишен за счет сокращения, клетки лизировали и биотинилированного белки были выделены стрептавидин аффинной хроматографии. Иммуноблота показывает общую DAT поверхности при т = 0 (Т), полоса контроля (S), а также внутреннюю DAT (I). Обратите внимание на видимом диапазоне в полосе контроля полосы, что свидетельствует о недостаточной эффективности полосы.

Discussion

Общие проблемы: Самая частая проблема, возникающая в этих экспериментах является низкая эффективность полосы. Эффективность полосы имеет решающее значение в том, чтобы уметь интерпретировать результаты. Если полоса была очень эффективной, это не возможно сделать вывод, что любой биотинилированного белков в интернализации полосы были, по сути, внутренним от поверхности. Полосы ≥ 90% эффективности являются оптимальными, и отбросить какие-либо результаты, если полоса падает ниже этого уровня. Пример плохой полосы показана на рисунке 3. Обратите внимание, что группа в полосе переулок хорошо видно, и соответствует полосе эффективность 34%. Если бедные эффективность полосы происходят, свежим TCEP не могли быть сделаны непосредственно перед добавлением к клеткам. Кроме того, TCEP может ухудшиться и новых реагентов должны быть приобретены. Использование порошка TCEP, а не решение, может обойти эту проблему.

Возможные изменения: В настоящем докладе, мы измерили относительное интернализации DAT курс, взятый в течение первых 10 минут интериоризации, и сравнил его с скорость интернализации DAT во время РКС активации. Кроме того, абсолютной скорости могут быть измерены при нагревании клеток для увеличения временных точках. Хотя это может быть возможно, наш опыт показывает, что низкий уровень сигнала на ранних временных точках, в сочетании с меж-экспериментальной изменчивости, не дают высокую воспроизводимость результатов на очень ранних временных точках. Кроме того, хотя мы использовали прилипшие клетки, анализ может быть модифицирован для клеточных суспензий. Ткань суспензий, таких как синаптосомах, также могут быть использованы. Тем не менее, крайне важно, чтобы целостность мембран впервые установлено. Если препарат имеет значительный процент "дырявые" мембран, биотинилирование реагента будет этикетке внутриклеточных белков, и это не будет возможным достоверно определить endocytic ставки. В этой ситуации, иммуноблотов также должны быть проверены внутриклеточных белков маркеров, таких как актин, для проверки внутриклеточного пула белка подвергался биотинилирование реагента.