מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Summary

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

Abstract

חלבונים פלזמה הממברנה הם קבוצה גדולה, מגוונת של חלבונים מורכבת של קולטנים, תעלות יונים, מובילי ומשאבות. פעילות של חלבונים אלה אחראי למגוון של אירועים הסלולר מפתח, כולל אספקת חומרי מזון, רגישות הסלולר, ואותות כימיים. רבים קרום חלבונים פלזמה מוסדרים באופן דינמי על ידי סחר endocytic, אשר מודולציה תפקוד החלבון על ידי שינוי פני השטח ביטוי חלבון. המנגנונים המאפשרים אנדוציטוזה חלבונים מורכבים אינם מובנים במלואם עבור חלבונים בממברנה רבים. כדי להבין את המנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבון מסוים, זה קריטי, כי שיעור endocytic של חלבון להימדד בדיוק. עבור קולטנים רבים, ישיר מדידות קצב endocytic מושגות לעתים קרובות ניצול ligands קולטן שכותרתו. עם זאת, עבור שיעורים רבים של חלבונים בממברנה, כגון מובילי, משאבות תעלות יונים, אין ליגנד נוח כי ניתן להשתמש כדי למדוד את קצב endocytic. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה biotinylation הפיך שאנו מעסיקים כדי למדוד את טרנספורטר דופאמין (DAT) שיעור endocytic. שיטה זו מספקת גישה פשוטה למדידת שיעורי הפנמה, והוא יכול בקלות להיות מועסק ללימודי סחר של חלבונים בממברנה ביותר.

Protocol

נוהל סקירה:

בגישה זו, משטח חלבוני התא מסומנים קוולנטית על זמין ליזין ושאריות תאית באמצעות impermeant קרום, דיסולפיד מצמידים מגיב biotinylation (sulfo-NHS-SS-ביוטין) בתנאים מגבילים סחר (כלומר בטמפרטורה נמוכה) עם ביוטין (ראה איור 1. להמחשה). קבוצה אחת של תאים מוסט לתנאי הסחר מתירנית (37 ° C) וחלבונים biotinylated להפנים. קבוצה אחרת של תאים נשמרים בטמפרטורה נמוכה כפקדי לחלבון 1) השטח הכולל בזמן = 0, ו 2) שליטה הפשטה. לאחר תקופה קצרה של הפנמה, התאים מועברים חזרה בטמפרטורה נמוכה כדי לעצור הפנמה, וכל ביוטין משטח שיורי הוא פשט על ידי טיפול בתאי עם סוכן צמצום, אשר cleaves ביוטין דיסולפיד מצמידים. חלבונים Biotinylated שנבעו תא השטח הופנמו מוגנים מפני הצעד הפשטה, ויהיה רק ​​חלבונים biotinylated שנותרו. בעקבות תמוגה התא, חלבונים biotinylated מבודדים על ידי streptavidin זיקה כרומטוגרפיה ואת החלבון של עניין הוא זוהה על ידי immunoblotting כמותי. כדי לקבוע את שיעור endocytic, בכמות החלבון הפנימו מושווה לשלוט על השטח הכולל שכותרתו בזמן = 0. השתמשנו בהצלחה בגישה זו כדי למדוד את קצב ההפנמה של נוראפינפרין ודופאמין העצבית ¹ מובילי ^1-4.

פרוטוקול מפורט:

יום 1:

1. פלייט תאים 6 צלחות גם כאלה שהם יהיו ומחוברות ~ 80% ביום 2. לחילופין, אם תאים transfected נמצאים בשימוש, transfect בצפיפות כזו שהם יהיו ומחוברות ~ 80% בזמן שיעור הפנמה תימדד. אם התאים אינם חסיד חזק, תרבות כלי רקמה יש לנהוג עם המצע תא הידבקות (למשל פולי-D-ליזין) כדי למנוע אובדן התא במהלך השלבים לשטוף נרחב.
2. עבור כל חלבון נבדק, 2 בארות צלחת על צלחת אחת לשמש חלבון את פני השטח הכולל (t = 0) בקרות הפשטה. על צלחת שנייה, צלחת אחת גם עבור כל תנאי הפנמה למבחן (כלומר שיעור endocytic הבסיס לעומת סמים מטופלים).
3. הכן את הפתרונות הבאים ולאחסן בטמפרטורה המצוין לשימוש יום 2:
   • PBS ^{2 +:} פוספט בופר (pH 7.4) בתוספת 1.5 מ"מ MgCl _2, 0.2 מ"מ CaCl _2, (4 ° C)
   • Biotinylation דובדבני פתרון: PBS ^{2 +} בתוספת 100 מ"מ גליצין, (4 ° C)
   • NT חיץ: 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.2% ארגון ה-BSA, 20 מ"מ טריס, pH 8.6, (4 ° C)
   • Ripa חיץ: 10 mM טריס, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.1% SDS, 1.0% טריטון X 100, deoxycholate נתרן 1.0%, (4 ° C)
   • Sulfo-NHS-SS-ביוטין פתרון המניות: להמיס dimethylsulfoxide (DMSO) עד 200 מ"ג / מ"ל, (-20 ° C)
   • טריס (2-Carboxyethyl) phosphine (TCEP) הידרוכלוריד פתרון במלאי: 500 מ"מ H ₂ O (-20 ° C, מכוסה בנייר כסף כדי לחסום את האור)

יום 2:

1. הכן PBS ^{2 +} בתוספת גלוקוז 0.18g/ml, 0.2% IgG / פרוטאז ללא שור בסרום אלבומין (PBS ^{2 +} / g / BSA). טרום חם פתרון זה 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
2. להפשיר את הפתרון sulfo-NHS-SS-ביוטין המניות על גבי הספסל כדי להמיס את DMSO. מיד לפני השימוש, להכין פתרון טרי sulfo-NHS-SS-ביוטין (2.5 מ"ג / מ"ל בקרח קר PBS ^{2 +,} די 0.75 מ"ל / טוב). הפתרון וורטקס במרץ solubilize DMSO. שים לב מגיב NHS-ביוטין הוא הידרוליזה בקלות בתמיסה מימית. לכן, כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים מיד לפני השימוש.
3. Biotinylation: מניחים על צלחות באמבט קרח בחדר קר ולשטוף 3 x 2 מ"ל עם קרח קר PBS ^{2 +.} הייה בטוח כי הצלחות הם בזווית מעט כדי לאפשר ניקוז מלא הסרת פתרון החיץ. הוסף 0.75 מ"ל / גם הפתרון sulfo-NHS-SS-ביוטין טריים היטב כל אחד. דגירה x 15 ', 4 ° C על באמבט קרח עם רעד נמרצת. לאחר דגירה תושלם, להכין פתרון אחר טרי sulfo-NHS-SS-ביוטין. החלף את הפתרון הישן עם פתרון טריים דגירה x 15 ', 4 ° C.
4. מרווה: זה קריטי, כי כל מי שאינו מגיב NHS-ביוטין מולקולות הרווה, כך שהם לא יגיבו עם biotinylate חלבונים תאיים פעם את התאים הם lysed. שטפו תאים 3 x 2 מ"ל עם פתרון מרווה ו דגירה פעמיים פתרון 2 מ"ל להרוות x 15 ', 4 ° C עם רעד עדין.
5. הפנמה: אם טיפולים תרופתיים נבדקות, להוסיף ריכוז התרופה המתאימה PBS ^{2 +} / g / BSA. שמור על צלחת מלאה ב 4 ° C ולהביא צלחת הפנמה מחוץ לחדר קר. לשטוף 3 x 2 מ"ל עם טרום חימם PBS ^{2 +} / g / BSA (+ / - drUGS) ולהשאיר בפתרונות אותו (2 מ"ל / טוב). מלא את כל בארות ריק עם פתרון מראש על מנת להבטיח חימם אפילו הטמפרטורה על פני הצלחת. העברת התאים 37 ° C חממה 10 '. בסמוך לפני סיום 37 ° C הדגירה, להכין TCEP טרי פתרון 50 מ"מ חיץ NT לשמש צעד חנות להפשיט על הקרח. הכינו כמות מספקת של 1.0 מ"ל / היטב.
6. שלילת: מיד הצלחת להעביר (ים) באמבט קרח לחזור לחדר קר. לשטוף במהירות תאים עם קרח קר NT חיץ, 3 x 2 מ"ל להפסיק אנדוציטוזה. כמו כן לשטוף את רצועת השליטה בארות 3 x 2 מ"ל עם חיץ NT. הוסף 1.0 מ"ל פתרון הפשטת טריים היטב כל אחד. לדגור על הקרח, 15 ', 4 ° C עם רעד עדין. החלף בארות עם פתרון הפשטת טריים דגירה נוסף 15 ', 4 ° C על הקרח.
7. תמוגה: לשטוף את כל הבארות נחשפו לפתרון הפשטה, 3 x 2 ml NT חיץ. ואז לשטוף את כל בארות (כולל בקרות סה"כ) עם 3 x 2 מ"ל PBS ^{2 +.} Lyse ב 300μl/well Ripa חיץ (או חיץ אחר תמוגה תואם לחלבון ריבית) המכיל מעכבי פרוטאז טריים (1.0 מ"מ PMSF, 1.0 מיקרוגרם / מ"ל ​​כל leupeptin, aprotinin ו pepstatin). Lyse ידי ניעור x 20 ', 4 ° C. העברה צינורות microfuge ופסולת הסלולר ברור ידי centrifuging 18,000 XG, 10 ', 4 ° C.
8. קביעת ריכוז חלבון: השתמש assay חלבון תואם התנאים תמוגה שלך (לדוגמה DC assay חלבון, Bio-Rad) כדי לקבוע את הריכוז של חלבון lysates לעומת עקומת BSA סטנדרטי.
9. Streptavidin זיקה כרומטוגרפיה: הכנת צינורות microfuge עם כמויות שוות ערך חלבון עבור כל דגימה. הוסף חוצץ תמוגה להביא את הנפח הסופי של כל דגימה כדי 200μl. וורטקס agarose חרוזים streptavidin נמרצות להביא להשעיית אפילו. שימוש pipettor 200μl עם קצה לחתוך, חרוזים פיפטה לתוך צינור אחד. מומלץ 20μl beads/50 lysate מיקרוגרם. דגירה לילה, 4 ° C על הכתף צינור.

יום 3:

1. כביסה ביד: דגימות צנטריפוגה, 18,000 XG, 2 "לאסוף חרוזים. לשאוב את lysate, נזהר לא להתקרב חרוז גלולה עם aspirator. השתמש קצה פיפטה פלסטיק על קצה aspirator על שליטה טובה יותר. הוסף 0.75 תמוגה מ"ל חיץ צינור אחד, והמערבולת לשטוף חרוזים. צנטריפוגה דגימות, 18,000 XG, 2 "לאסוף חרוזים השאיפה לחזור ושטיפת פעמיים (שלוש שוטפת בסך הכל). לאחר לשטוף הסופי, לשאוב כמה שיותר למאגר ככל האפשר מבלי להפריע גלולה חרוז. תשר צינור לעבר aspirator מסייעת עם הצעד הזה.
2. Elution לדוגמא: הוספת 20-25μl 2x חיץ Laemmli דגימה (הקטנת) על צינור אחד. הסוכן הפחתת לדבוק יהיה הקשר NHS-SS-ביוטין דיסולפיד, משחררים את החלבונים מבודדים לתוך תמיסה. חלבונים בממברנה רוב פגיע מאוד צבירה כאשר מבושל, ולא צריך להיות מחומם לפני העמסה על ג'לים עבור עמוד SDS. קביעת רגישות לחום של חלבון העניין שלך לפני ביצוע הניסויים האלה. אם החלבון לא יכול לסבול חימום רותחים /, דגירה על הכתף, 30 ', בטמפרטורת החדר לפני ניתוח על ידי-SDS. זה מספיק כדי האג"ח דיסולפיד לדבוק ו elute את החלבונים.
3. SDS-PAGE ו immunoblotting: חלבונים נפרדת על ידי-SDS. עבור כל מדגם, היא הקלה ביותר להפעיל את הדגימות לפי הסדר הבא: השטח הכולל (זמן = 0), רצועה, מצב הפנמה # 1, מצב 2, וכו 'העברה קרום עבור immunoblotting ואת כתם עם נוגדן מתאים לחלבון שלך של עניין. לכידת להקות immunoreactive באמצעות מצלמת CCD-תיעוד מערכת ג'ל, להיות בטוח שאין פיקסלים רוויים. לכמת כל צפיפות הלהקה באמצעות ניתוח / צפיפות תוכנה ג'ל.

נציג תוצאות:

התוצאה immunoblot נציג מוצג באיור 2A. האות החזק ביותר נמצא במסלול "סך הכל" (T), שהוא הסכום הכולל של חלבון פני השטח לפני הפנמה. "רצועה" שליטה (S) רצוי קרוב ריק, אשר מוכיח כי הרצועה היתה יעילה לצורך הניסוי. יעילות רצועת מחושב על ידי השוואת צפיפות של נתיב "רצועה" לזה של מסלול "סך הכל" (חלבון כגון שהיה biotinylated במקביל עם רצועה, אבל לא היה מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ולא חשופים פתרון הפשטה). הנוסחה הבאה משמשת:

[1 - (רצועה / סה"כ)] * 100%

שימוש בנוסחה זו, רצועת באיור 2 היה 99.8% יעיל. לבסוף, תוכלו לראות להקות של עוצמה פחותה מאשר סך בנתיב הפנמה (ים) (I). בדוגמה (איור 2), בתאים שטופלו טופלו רכב או 1μM אצטט myristate phorbol (PMA) במהלך 10 'שיעורי הפנמה הפנמה דופמין טרנספורטר נמדדו 10' תקופת ההפנמה הראשונית. שיעור הפנמה מחושבכדלקמן:

הפנימו / סה"כ * 100

כפי שניתן לראות באיור 2B, משטח DAT 10.4% הפנימו מעל 10 'תחת הרכב שטופלו תנאים. PMA טיפול מוגבר שיעורי DAT הפנמה עד 23.2% משטח הכולל של DAT.

באיור 1. תאים איור פרוטוקול. Biotinylated הם ב 4 ° C עד התווית באופן בלעדי את האוכלוסייה פני השטח, והם עברו 37 ° C ליזום הפנמה. בעקבות הפנמה, תאים מקורר במהירות כדי לעצור תהליכים endocytic ו ביוטין משטח שיורי הוא פשט על ידי טיפול בתאי עם סוכן צמצום. רק חלבונים biotinylated שנותרו הם אלו שעלו מן השטח בזמן t = 0 ו הופנמו, ובכך להגן עליהם מפני הטיפול הפשטה. חלבונים Biotinylated מבודדים על ידי אצווה זיקה כרומטוגרפיה עם חרוזים streptavidin ואת החלבון של עניין הוא זוהה על ידי immunoblotting.

איור 2. הפעלת PKC מגביר את קצב DAT endocytic. Assay הפנמה. PC12 התאים ביציבות להביע DAT היו biotinylated, 4 ° C כמתואר "פרוטוקול מפורט". תאים הם חיממו במהירות 37 ° C ± 1 מיקרומטר PMA וטופחו 10 ', 37 ° C. ביוטין שיורית הופשט ידי הקטנת התאים היו lysed וחלבונים biotinylated בודדו ע"י כרומטוגרפיה זיקה streptavidin. (א) נציג immunoblot מראה DAT השטח הכולל ב t = 0 (ט), רצועה שליטה (S), ו DAT הפנימו (אני) בתנאים המצוין. (ב) להקות נתפסו עם מצלמת CCD ו לכמת עם כמות נתונים תוכנה (Bio-Rad). הנתונים כפי שבאה לידי ביטוי% מסך דק internalized/10 DAT.

איור 3. Immunoblot דוגמה המתארת ​​רצועת עניים ביוטין. הפנמה assay. PC12 התאים ביציבות להביע DAT היו biotinylated, 4 ° C כמתואר "פרוטוקול מפורט". תאים הם חיממו במהירות 37 ° C ו מודגרות 10 ', 37 ° C. ביוטין שיורית הופשט ידי הקטנת התאים היו lysed וחלבונים biotinylated בודדו ע"י כרומטוגרפיה זיקה streptavidin. Immunoblot מראה DAT השטח הכולל ב t = 0 (ט), רצועה שליטה (S), ו הפנימו DAT (אני). הערה הלהקה גלוי בנתיב לשלוט ברצועה, מעיד על יעילות רצועת עניים.

Discussion

בעיות נפוצות: הבעיה הנפוצה ביותר שעולה בניסויים אלה הוא יעילות רצועת עניים. את היעילות של הרצועה הוא קריטי להיות מסוגל לפרש את התוצאות. אם הרצועה היתה היעילה ביותר, לא ניתן להסיק כי כל החלבונים biotinylated בסמטאות הפנמה היו, למעשה, הפנימו מפני השטח. רצועות ≥ יעילות 90% הם אופטימליים, ואנחנו להשליך כל התוצאות אם רצועת יורד מתחת לרמה זו. דוגמה של רצועת עני מוצג באיור 3. שים לב כי הלהקה בנתיב רצועת גלוי למדי, מתאים יעילות רצועה של 34%. אם יעילות רצועת עניים להתרחש, TCEP טריים עשויים שלא נעשו מיד לפני הוספת התאים. לחלופין, TCEP עשוי להיות מושפלת מגיב החדש יהיה צורך לרכוש. שימוש באבקת TCEP, ולא פתרון, עלולים לעקוף את הבעיה הזו.

שינויים אפשריים: בדו"ח הנוכחי, מדדנו קצב הפנמת יחסי DAT, השתלטו במהלך 10 דקות הראשונית של הפנמה, והשווה אותה לשיעור הפנמה DAT במהלך הפעלת PKC. לחלופין, שיעור מוחלט יכול להימדד על ידי תאים התחממות להגדלת נקודות זמן. אמנם זה עשוי להיות אפשרי, מנסיוננו עולה כי רמות אות נמוך מוקדם נקודות זמן, יחד עם השתנות בין ניסיוני, לא הניב תוצאות מאוד לשחזור בבית מוקדם מאוד זמן נקודות. כמו כן, למרות שהיינו תאים חסיד, assay יכול להיות שונה עבור השעיות התא. המתלים רקמות, כגון synaptosomes, יכול לשמש גם. עם זאת, קיים הכרח כי על שלמות הקרומים הוא הוקם לראשונה. אם התכשיר יש אחוז משמעותי של ממברנות "דולף", מגיב biotinylation יהיה תווית חלבונים תאיים ולא ניתן יהיה לקבוע באופן אמין את שיעור endocytic. במצב זה, immunoblots צריך להיות גם נחקר על חלבון סמן תאיים, כגון אקטין, כדי לבדוק אם הבריכה חלבונים תאיים נחשף מגיב biotinylation.