Summary
规管的内吞作用管辖的大部分膜蛋白在细胞表面的表达水平。在这里，我们利用还原，膜impermeant生物素化试剂的多巴胺转运蛋白（DAT），一个多面体的膜蛋白的内吞率来衡量的。该方法有利于一个简单的方法来测量大多数等离子的膜蛋白的内吞率。
Abstract
质膜蛋白是一种大型的，不同群体的蛋白质受体，离子通道，运输和泵组成。这些蛋白质的活性是负责各种关键的细胞活动，包括营养输送，细胞的兴奋性，和化学信号。许多质膜蛋白质吞贩运，调节通过改变蛋白的表面表达的蛋白质的功能是动态监管。促进蛋白质的内吞作用的机制，是复杂的，并不完全理解许多膜蛋白。为了充分了解的机制，控制某一特定蛋白质的内吞贩运，它是至关重要的蛋白S吞率精确测量。对于许多受体，直接吞率测量经常利用标记的受体的配体。然而，对于许多类，如运输，泵和离子通道的膜蛋白，有没有方便的配体，可以用来衡量吞率。在本报告中，我们描述了一个可逆的生物素的方法，我们聘请来衡量的多巴胺转运蛋白（DAT）的内吞率。这种方法提供了一个简单的方法来测量的内化率，并且可以很容易地雇用贩运大多数膜蛋白研究。
Protocol
程序概述：
使用这种方法，细胞表面的蛋白质共价键上标有使用贩运的限制性条件（即低温）下一个膜impermeant，二硫化碳耦合生物素试剂（磺酸基- NHS - SS -生物素）外赖氨酸残基与生物素（见图1插图）。一个细胞转移到贩卖宽松的条件下（37℃）和生物素化蛋白的内化。其他细胞保持在较低的温度控制为1）总时间= 0的表面蛋白，和2）剥离控制。一化后的短期内，细胞移回低温停止内部化，任何残留的表面生物素是治疗还原剂，劈开二硫键再加生物素细胞剥离。来自细胞表面和内在的生物素标记的蛋白质是保护剥离一步，将是唯一保持生物素化蛋白。细胞裂解，生物素蛋白链霉亲和素亲和层析柱分离和利益的蛋白质是由定量免疫印迹检测。要确定吞率，内在蛋白量相比，总面控制在时间= 0标记。我们已经成功地使用这种方法来测量内部的神经元的去甲肾上腺素 1和多巴胺 1-4转运率。
详细的协议：
第1天：
- 板细胞在6孔板等，他们将第2天〜80％融合。另外，如果正在使用的转染细胞，转染密度的内化率将测得的时间，他们将在〜80％融合。如果没有强烈的贴壁细胞，组织培养器皿应被视为与细胞粘附底物（如聚- D -赖氨酸）广泛的洗涤步骤，以防止在细胞丢失。
- 每个蛋白质正在测试中，板2上的一个板块水井，作为总的表面蛋白（T = 0）和剥离控制。在第二个板块，板块之一为每个被测试的内化条件（即基底吞率与药物治疗）。
- 准备以下解决方案，在第2天使用指定的温度和存储：
- PBS洗涤2 +：磷酸盐缓冲液（pH值7.4），1.5毫米0.2 毫米氯化钙， 氯化镁 2，（4 ° C）补充
- 生物素淬火解决方案 ：PBS 2 +辅以甘氨酸，100毫米（4℃）
- NT缓冲区 ：150毫米氯化钠，1.0 mM的EDTA，0.2％BSA，20毫米三，pH值8.6，（4℃）
- RIPA缓冲液 ：氯化钠150毫米，10毫米的Tris，pH值7.4，1.0 mM的EDTA，0.1％SDS，1.0％TRITON X 100，脱氧胆酸钠，1.0％（4 ° C）
- 磺酸基- NHS - SS -生物素储备液 ：溶解于二甲基亚砜（DMSO）为200毫克/毫升（-20 ° C）
- 三（2 -羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）原液：500 毫米 ，H 2 O（-20 ° C，在铝箔覆盖挡光）
第2天：
- 准备PBS洗涤2 +辅以0.18g/ml葡萄糖，0.2％，IgG /蛋白酶的无牛血清白蛋白（PBS洗涤2 + /克/ BSA） 。预温至37 ° C水浴中的解决方案。
- 台式磺酸基- NHS - SS -生物素原液解冻融化的二甲基亚砜。立即使用前，准备新鲜的磺酸基- NHS - SS -生物素的溶液（2.5毫克/毫升，在冰冷的 PBS 2 +，足以为0.75毫升/井）。旋涡的解决方案，大力溶解在二甲基亚砜。需要注意的是NHS -生物素试剂在水溶液中很容易水解。因此，所有的解决方案，应立即准备前使用。
- 生物素：在寒冷的房间里的冰浴上放置板和冲洗用冰冷的 PBS 2 3 × 2毫升。某些板块略有角度，以便完成排水和清除缓冲液。添加0.75 /毫升的新鲜磺酸基- NHS - SS -生物素的解决方案，每个以及。孵育x 15'，4℃冰浴剧烈摇晃彗星。孵化完成后，准备另一个新的磺酸基- NHS - SS -生物素的解决方案。更换旧的解决方案，与新鲜的解决方案和孵化× 15'，4 ° C。
- 淬火：至关重要的是，NHS -生物素分子的所有非反应淬，所以，他们不会做出反应，并biotinylate细胞内的蛋白质，一旦细胞裂解。淬火液洗涤细胞3 × 2毫升和淬火的解决方案2毫升× 15'，4 °与轻轻摇动孵化两次。
- 内在：如果正在测试的药物治疗，适当的药物浓度， 以PBS 2 + /克/ BSA。保持在4 ° C的控制盘和内化板的冷室。预热PBS洗3 × 2毫升+ / G / BSA（+ / - DRUGS），并留在相同的解决方案（2毫升/孔）。填写任何空井预热的解决方案，以确保整个板块的温度均匀。细胞转移到37℃培养箱中培养10'。立即结束前37 ° C孵化，准备在NT缓冲新鲜的50毫米TCEP解决方案，被剥离的步骤，并存储在冰上。准备足够量为1.0毫升/。
- 脱模：立即传送板（S），冰浴，并返回到冷房。快速洗细胞与冰冷NT缓冲区，3 × 2毫升停止内吞作用。还用NT的缓冲地带的控制井3 × 2毫升。添加1.0毫升新鲜剥离的解决方案，每孔。在冰上孵育，轻轻摇动15'，4 ° C。井更换新鲜剥离的解决方案，并在冰上孵育15'，4 ° C。
- 裂解：清洗所有暴露剥离的解决方案，3 × 2毫升NT缓冲井。然后用3 × 2毫升PBS +所有的水井（包括总控制） 。裂解在300μl/wellRIPA缓冲液，含有新鲜的蛋白酶抑制剂（PMSF，1.0毫米1.0微克/毫升每亮肽素，抑肽酶和胃酶抑素）（或其他感兴趣的蛋白质裂解液兼容）。裂解通过晃动× 20'，4 ° C。转移到离心管和清除细胞碎片，离心18000 XG，10'，4 ° C。
- 测定蛋白浓度：与您的裂解条件（ 例如 DC蛋白测定，Bio - Rad公司）兼容使用蛋白检测，以确定的裂解液中的蛋白浓度相比，一个标准的牛血清白蛋白曲线。
- 链霉亲和素亲和层析法 ：准备与蛋白质的等值金额，每个样品的离心管。加入裂解缓冲液中，使每个样品的最终体积200μL。旋涡链霉亲和素琼脂糖珠大力带来更被停牌。使用提示200μL的移液器切断，每个管的吸液管珠。推荐微克裂解液20μLbeads/50。在管肩孵育过夜，于4℃。
第3天：
- 珠清洗：离心机样品，18000 XG 2“收集珠子。吸过裂解液，小心不要接近吸气珠颗粒。更好地控制抽吸结束使用塑料枪头。添加0.75毫升每管细胞裂解液，和涡洗珠。离心样品，18000 XG 2“收集珠子和重复的愿望和洗两次（共三个清洗）。最后一次洗涤后，吸出，而不会干扰磁珠颗粒尽可能多的缓冲区。小费向管抽吸助攻这一步。
- 样品洗脱：每管加入20 -25μl2X Laemmli样品缓冲液（减少）。还原剂将切割NHS的SS -生物素的二硫键，释放到溶液中分离蛋白质。大多数膜蛋白是非常脆弱的聚合煮沸时，不应该加热前进行SDS - PAGE凝胶装载。确定你感兴趣的蛋白质的热敏感性前进行这些实验。如果蛋白质无法容忍沸腾/加热，旋转器，30'，室温孵育前经SDS - PAGE分析。这是足够的切割二硫键和洗脱的蛋白质。
- SDS - PAGE电泳和免疫印迹：经SDS - PAGE分离蛋白质。对于每个样本，这是最简单的运行样品，按下列顺序：（时间= 0）的总表面积，带钢，内化的条件1，条件2＃等免疫印迹膜转移与相应的抗体印迹的蛋白质利益。捕获使用CCD相机凝胶的文件系统，一定有不饱和像素的免疫反应乐队。使用凝胶电泳分析/密度测量软件，量化每个波段的密度。
代表性的成果：
一个代表性的免疫印迹结果显示在图2A。信号最强的是“总”巷（T）的，这是表面蛋白总量前的内化。最好应接近空白，这表明，带钢实验的有效的“脱衣”控制（S）。地带效率的计算方法是比较“地带”里的“总”里（如蛋白质，是平行的地带生物素的密度，但既不是加热至37 ° C，也没有暴露剥离的解决方案）。使用下列公式：
[1 - （条/总）] × 100％
使用这个公式，在图2的地带是99.8％的效率。最后，你会看到比（S）（一）在化巷总强度较小的波段。在这个例子中（图2），细胞治疗，治疗无论是车辆或1μm的佛波醇酯（PMA），在10“内化和多巴胺转运的内化率分别测定10”最初的内部化时期。内化率的计算公式为如下：
内在/总* 100
如图2b所示，10.4％的表面的DAT内超过10“车辆处理的条件下。 PMA的治疗增加了23.2％的总表面的DAT DAT内化率。
图1。议定书“的插图。细胞是生物素在4 ° C至专门标签表面的人口，并转移至37 ° C至启动的内化。内化后，细胞迅速冷却至停止内吞作用的过程和剩余的表面生物素是治疗还原剂细胞剥离。唯一保持生物素化蛋白是指那些出现在t = 0的表面和内部化，从而保护他们从剥离治疗。生物素标记的蛋白质分离出一批与链霉亲和素磁珠亲和层析和利益的蛋白质是由免疫印迹检测。
图2。 PKC的激活，增加了DAT吞率 。内在检测。 PC12细胞中稳定表达的DAT生物素，4 ° C“详细的协议”中所述。细胞被迅速加热到37 ° Ç ± 1μMPMA和孵育10'，37 ° C。剥离减少残留的生物素，细胞裂解和生物素蛋白中分离链霉亲和素亲和层析柱。 （一）代表免疫印迹显示的总表面积的DAT，在t = 0（T）地带的控制权（S）和内在DAT（一）所指出的条件下。 （二）带被抓获CCD相机和量化与数量数据软件（BIO - RAD）。数据表示为％的总DAT internalized/10分钟。
图3。例免疫印迹描绘一个穷人的生物素地带 。内在检测。 PC12细胞中稳定表达的DAT生物素，4 ° C“ 详细的协议 ”中所述。细胞被迅速加热到37℃，孵育10'，37 ° C。剥离减少残留的生物素，细胞裂解和生物素蛋白中分离链霉亲和素亲和层析柱。免疫印迹显示总表面的DAT在t = 0（T）地带的控制权（S）和内在DAT（一）。注意地带的控制权弄在可见光波段，表明地带效率差。
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Discussion
常见问题 ：在这些实验中出现的最常见的问题是贫困地带效率。地带的效率是能够解释结果的关键。除非地带高效，是不可能得出结论，任何生物素化蛋白的内化车道，事实上，从表面上看内在。带≥90％的效率是最优的，和我们放弃任何结果，如果低于这个水平的地带。一个贫困地带的一个例子是如图3所示。请注意，在加沙地带车道的乐队是非常明显的，并对应一个34％的地带效率。如果发生地带效率差，可能不新鲜TCEP已立即作出之前，增加细胞。另外，TCEP可能会退化，将需要购买新的试剂。 TCEP粉的使用，而不是解决方案，可能会绕过这个问题。
可能的修改：在当前的报告中，我们测得的相对DAT内化率，在最初的10分钟内化的过程中所采取，DAT内化率相比，在PKC的激活。另外，可以测量一个绝对的速度变暖细胞增加的时间点。虽然这是可能的，我们的经验表明，在早期的时间点低的信号水平，再加上实验间变异，不屈服在很早的时候点的高度可重复性的结果。此外，虽然我们使用的贴壁细胞，可以修改检测细胞悬液。组织的悬浮液，如突触，也可以使用。然而，这是当务之急，是首先建立了膜的完整性。如果准备有很大比例的“漏”膜，生物素化试剂将细胞内蛋白质贴上标签，将无法可靠地确定吞率。在这种情况下，免疫印迹，也可以探测细胞内标记蛋白质，如肌动蛋白，测试细胞内蛋白质池是否被暴露的生物素化试剂。
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Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予＃DA15169到下摆
References
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