Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

Summary

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Abstract

Plasmamembraan eiwitten zijn een grote en diverse groep van eiwitten bestaat uit receptoren, ionenkanalen, transporteurs en pompen. De activiteit van deze eiwitten is verantwoordelijk voor een verscheidenheid van belangrijke cellulaire gebeurtenissen, zoals de afgifte van voedingstoffen, cellulaire prikkelbaarheid, en chemische signalen. Veel plasma-membraan-eiwitten worden dynamisch geregeld door endocytische mensenhandel, die proteïne functie moduleert door het veranderen van eiwit-oppervlakte-expressie. De mechanismen die eiwitten endocytose te vergemakkelijken zijn complex en niet volledig begrepen voor veel membraaneiwitten. Om ten volle te begrijpen van de mechanismen die de endocytische handel in een bepaald eiwit controle, is het essentieel dat het eiwit s endocytische snelheid nauwkeurig worden gemeten. Voor veel receptoren, zijn directe endocytische rate metingen vaak bereikt gebruik te maken van het label receptor liganden. Echter, voor vele klassen van membraaneiwitten, zoals vervoerders, pompen en ion kanalen, is er geen geschikte ligand dat gebruikt kan worden om de endocytische meten. In dit rapport beschrijven we een omkeerbare biotinylatie methode die we gebruiken om de dopamine transporter (DAT) endocytische meten. Deze methode biedt een eenvoudige benadering van het meten van internalisatie tarieven, en kan gemakkelijk worden gebruikt voor handel in studies van de meeste membraaneiwitten.

Protocol

Procedure overzicht:

Met behulp van deze aanpak worden cel-oppervlakte-eiwitten covalent gelabeld met biotine op de beschikbare extracellulaire lysineresiduen met behulp van een membraan impermeant, disulfide-gekoppeld biotinylatie reagens (sulfo-NHS-SS-biotine) onder mensenhandel beperkende voorwaarden (dat wil zeggen lage temperatuur) (zie fig. 1. ter illustratie). Een set van cellen is verschoven naar mensenhandel tolerante omstandigheden (37 ° C) en gebiotinyleerd eiwitten te internaliseren. De andere set van cellen worden bewaard bij lage temperatuur als controle voor 1) de totale oppervlakte-eiwit op het tijdstip = 0, en 2) strippen van controle. Na een korte periode van internalisatie, worden de cellen weer verschoven naar lage temperatuur tot internalisatie te stoppen, en de eventuele resterende oppervlakte biotine is ontdaan door het behandelen van cellen met een reductiemiddel, die de disulfide-gekoppelde biotine splitst. Gebiotinyleerde eiwitten die ontstaan ​​uit het celoppervlak en werden geïnternaliseerd worden beschermd tegen de strippen stap, en zal de enige gebiotinyleerde eiwitten die blijven. Na cellysis, zijn gebiotinyleerde eiwitten geïsoleerd door streptavidine affiniteitschromatografie en het eiwit van belang wordt gedetecteerd door kwantitatieve immunoblotting. Voor het bepalen van de endocytische tarief is het bedrag van de geïnternaliseerde eiwit ten opzichte van de totale oppervlakte controle die ten tijd = 0. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze benadering van de internalisatie tarief van de neuronale noradrenaline en dopamine ^{een 1-4} transporters te meten.

Gedetailleerde Protocol:

Dag 1:

1. Plaat cellen in 6 well platen zodanig dat ze ~ 80% confluent op dag 2. Als alternatief, indien getransfecteerde cellen worden gebruikt, transfecteren met een dichtheid zodanig dat ze ~ 80% confluent zijn op het moment dat de internalisatie tarief zal worden gemeten. Als cellen niet sterk hechtende, moet weefselkweek software worden behandeld met een celadhesie substraat (bv poly-D-lysine) de cel te voorkomen tijdens de uitgebreide wasbeurt stappen.
2. Voor elk eiwit wordt getest, op bord twee putten op een plaat worden gebruikt als de totale oppervlakte-eiwit (t = 0) en het strippen van controles. Op een tweede plaat, plaat een goed voor elk internalisatie conditie worden getest (dat wil zeggen basale endocytische rate ten opzichte van drugs behandeld).
3. Bereid de volgende oplossingen en bewaar bij de aangegeven temperaturen voor gebruik op Dag 2:
   • PBS ^{2 +:} Fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4), aangevuld met 1,5 mM _MgCl2, 0,2 mM CaCl _2, (4 ° C)
   • Biotinylatie Quench Oplossing: PBS ^{2 +} aangevuld met 100 mM glycine, (4 ° C)
   • NT buffer: 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0,2% BSA, 20 mM Tris, pH 8,6, (4 ° C)
   • RIPA buffer: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0,1% SDS, 1,0% Triton X 100, 1,0% natriumdeoxycholaat, (4 ° C)
   • Sulfo-NHS-SS-biotine-stamoplossing: Los op in dimethylsulfoxide (DMSO) tot 200 mg / ml, (-20 ° C)
   • Tris (2-carboxyethyl) fosfine Hydrochloride (TCEP) stock-oplossing: 500 mm in H ₂ O, (-20 ° C, bedekt met folie om licht te blokkeren)

Dag 2:

1. Bereid PBS ^{2 +} aangevuld met 0.18g/ml glucose, 0,2% IgG / protease-vrije bovine serum albumine (PBS ^{2 +} / g / BSA). Pre-warm deze oplossing tot 37 ° C in een waterbad.
2. Ontdooi de sulfo-NHS-SS-biotine-stockoplossing op de bank boven naar de DMSO smelten. Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, voor te bereiden verse sulfo-NHS-SS-biotine-oplossing (2,5 mg / ml in ijskoud PBS ^{2 +,} voldoende voor 0,75 ml / putje). Vortex de oplossing krachtig om de DMSO lossen. Merk op dat de NHS-biotine reagens is gemakkelijk gehydroliseerd in een waterige oplossing. Daarom moeten alle oplossingen voor onmiddellijk bereid zijn te gebruiken.
3. Biotinylatie: Plaats platen op een ijsbad in de koude kamer en 3 x 2 ml spoelen met ijskoud PBS ^{2 +.} Wees er zeker van dat platen lichtjes schuin om voor volledige afvoer en verwijdering van de bufferoplossing. Voeg 0,75 ml / putje van de verse sulfo-NHS-SS-biotine-oplossing aan elk putje. Incubeer x 15 ', 4 ° C op het ijs bad met krachtig schudden. Na de incubatie is voltooid, een ander voor te bereiden verse sulfo-NHS-SS-biotine-oplossing. Vervang de oude oplossing met de verse oplossing en incubeer x 15 ', 4 ° C.
4. Afschrikken: Het is essentieel dat alle niet-reageren NHS-biotine-moleculen zijn uitgeblust, zodat ze niet zullen reageren met en biotinylate intracellulaire eiwitten zodra de cellen worden gelyseerd. Was de cellen 3 x 2 ml met afschrikken oplossing en incubeer twee keer in 2 ml blussen oplossing x 15 ', 4 ° C onder zacht schudden.
5. Internalisatie: Als behandeling met medicijnen worden getest, passende concentratie van het geneesmiddel toe te voegen aan PBS ^{2 +} / g / BSA. Controle te houden plaat staan ​​bij 4 ° C en breng internalisatie plaat uit de koelcel. Was 3 x 2 ml met voorverwarmd PBS ^{2 +} / g / BSA (+ / - drUGS) en laat in dezelfde oplossingen (2 ml / putje). Vul alle lege putten met voorverwarmd oplossing voor gelijkmatige temperatuur zorgen over de plaat. Overdracht van de cellen om een ​​37 ° C incubator voor 10 '. Onmiddellijk voorafgaand aan het einde van de 37 ° C incubatie, voor te bereiden verse 50 mM TCEP-oplossing in NT buffer te worden gebruikt voor het strippen stap en op te slaan op het ijs. Bereid voldoende voor 1,0 ml / putje.
6. Strippen: Onmiddellijk overdracht plaat (s) ijsbad en terug te keren naar koude kamer. Snel wassen cellen met ijskoude NT-buffer, 3 x 2 ml tot endocytose te stoppen. Ook wassen strip controle putten 3 x 2 ml met NT buffer. Voeg 1,0 ml vers stripoplossing aan elk putje. Incubate op het ijs, 15 ', 4 ° C onder zacht schudden. Vervang de putten met verse stripping-oplossing en incubeer een extra 15 ", 4 ° C op het ijs.
7. Lysis: Was alle putten die werden blootgesteld aan stripoplossing, 3 x 2 ml NT buffer. Was daarna alle putjes (inclusief totaal controles) met 3 x 2 ml PBS ^{2 +.} Lyse in 300μl/well RIPA buffer (of een ander lysisbuffer geschikt voor het eiwit van belang) met vers proteaseremmers (1,0 mM PMSF, 1,0 ug / ml per leupeptin, aprotinine en pepstatine). Lyse door schudden x 20 ', 4 ° C. Transfer naar microfugebuizen buizen en duidelijke cellulaire puin door centrifugeren 18.000 xg, 10 ', 4 ° C.
8. Eiwitconcentratie bepaling: Gebruik een eiwit assay compatibel is met uw lysis aandoeningen (bijv. DC eiwit assay, Bio-Rad) aan de eiwitconcentratie van de lysaten te bepalen ten opzichte van een standaard BSA curve.
9. Streptavidine affiniteitschromatografie: Bereid microfugebuizen buizen met gelijke hoeveelheden van de eiwitten voor elk monster. Voeg lysis buffer aan de uiteindelijke omvang van elk monster te brengen 200μl. Vortex de streptavidine agarose parels met klem aan te brengen in een nog schorsing. Met behulp van een 200μl pipet met de tip afgesneden, pipet parels in elke buis. Aanbevolen 20μl beads/50 ug lysaat. Incubeer overnacht, 4 ° C op een buis rotator.

Dag 3:

1. Kraal wassen: Centrifuge monsters, 18.000 xg, 2 'kralen te verzamelen. Aspireren uit lysaat, dat evenwel niet tot kraal pellet benaderen met aspirator. Gebruik een plastic pipet tip over het einde van de aspirator voor een betere controle. Voeg 0,75 ml lysis buffer aan elke buis, en vortex tot kralen te wassen. Centrifuge monsters, 18.000 xg, 2 'om kralen en herhalen aspiratie verzamelen en wassen twee keer (drie wasbeurten in totaal). Na de laatste wasbeurt, aspiratie zoveel mogelijk van de buffer mogelijk zonder verstoring van de kraal pellet. Kantelen van de buis in de richting van de aspirator helpt met deze stap.
2. Sample elutie: Voeg 20-25μl 2x Laemmli sample buffer (verminderen) aan elke buis. Het reductiemiddel zal klieven van de NHS-SS-biotine disulfidebinding, het loslaten van de geïsoleerde eiwitten in de oplossing. De meeste membraaneiwitten zijn zeer kwetsbaar voor aggregatie bij gekookt, en mag niet eerder worden verwarmd tot het laden op de gels voor SDS-PAGE. Bepaal warmte gevoeligheid van je eiwit van belang voor het uitvoeren van deze experimenten. Als eiwit kan niet tegen koken / verwarming, voordat incuberen op een rotator, 30 ', kamertemperatuur op de analyse door middel van SDS-PAGE. Dit is voldoende om splijten van de disulfidebinding en elueer de eiwitten.
3. SDS-PAGE en immunoblotting: Aparte eiwitten door SDS-PAGE. Voor elk monster, is het het gemakkelijkst om de monsters uitgevoerd in de volgende volgorde: de totale oppervlakte (tijd = 0), strip, internalisatie voorwaarde # 1, # 2 Staat, enz. Transfer naar membraan voor immunoblotting en dep met de juiste antilichaam voor uw proteïne van belang. Capture immunoreactieve bands met behulp van een CCD-camera gel documentatiesysteem, de zekerheid dat er geen verzadigd pixels. Kwantificeren elke band dichtheid met behulp van gel analyse / densitometrie software.

Representatieve resultaten:

Een vertegenwoordiger immunoblot resultaat is weergegeven in figuur 2A. Het sterkste signaal is in de "totale" lane (T), dat is totale hoeveelheid oppervlakte-eiwit voorafgaand aan de internalisatie. De "strip" controle (S) idealiter dicht bij leeg, waaruit blijkt dat de strook efficiënt was voor het experiment. De strip rendement wordt berekend door het vergelijken van de dichtheid van de "strip" lane met die van de "totaal" lane (bijv. eiwit dat was gebiotinyleerd parallel met de strip, maar was niet verwarmd tot 37 ° C of blootgesteld worden aan stripoplossing). De volgende formule wordt gebruikt:

[1 - (strip / totaal)] * 100%

Met behulp van deze formule, de strip in figuur 2 was 99,8% efficiënt. Tot slot ziet u banden van mindere intensiteit dan het totaal in de internalisatie rijstrook (s) (I). In het voorbeeld (figuur 2), behandelde cellen werden behandeld met ofwel voertuig of 1 uM forbol myristaat acetaat (PMA) tijdens een 10 'internalisatie en dopamine transporter internalisatie tarieven waren gemeten voor een 10 "eerste internalisatie periode. De internalisering wordt berekend alsvolgt:

geïnternaliseerd / totaal * 100

Zoals te zien in figuur 2B, 10,4% oppervlakte DAT geïnternaliseerd meer dan 10 'onder het voertuig behandeld omstandigheden. PMA behandeling DAT internaliseren tarieven verhoogd tot 23,2% van de totale oppervlakte DAT.

Figuur 1. Protocol illustratie. Cellen zijn gebiotinyleerd bij 4 ° C om uitsluitend de oppervlakte bevolking label, en worden verschoven naar 37 ° C tot internalisatie te starten. Na internalisatie, cellen snel gekoeld tot endocytische processen en resterende oppervlakte biotine te stoppen is ontdaan door het behandelen van cellen met een reductiemiddel. De enige gebiotinyleerde eiwitten die blijven zijn die ontstaan ​​uit het oppervlak op t = 0 en werden geïnternaliseerd, waardoor hen te beschermen tegen het strippen behandeling. Gebiotinyleerde eiwitten worden geïsoleerd door de batch affiniteitschromatografie met streptavidine kralen en het eiwit van belang wordt gedetecteerd door immunoblotting.

Figuur 2. PKC activatie verhoogt de DAT-endocytische tarief. Internalisatie test. PC12 cellen die stabiel tot expressie DAT waren gebiotinyleerd, 4 ° C, zoals beschreven in "Gedetailleerde Protocol". Cellen werden snel opgewarmd tot 37 ° C ± 1 uM PMA en geïncubeerd 10 ', 37 ° C. Residuele biotine werd uitgekleed door het verminderen, werden de cellen gelyseerd en gebiotinyleerde eiwitten werden geïsoleerd door streptavidine-affiniteitschromatografie. (A) Representatieve immunoblot met totale oppervlakte DAT op t = 0 (T), strip controle (S), en geïnternaliseerd DAT (I) onder de aangegeven voorwaarden. (B) Bands werden gemaakt met een CCD-camera en gekwantificeerd met de hoeveelheid gegevens software (Bio-Rad). De gegevens zijn uitgedrukt als% van het totaal DAT internalized/10 min.

Figuur 3. Voorbeeld immunoblot afbeelding van een slechte biotine strip. Internalisatie test. PC12 cellen die stabiel tot expressie DAT waren gebiotinyleerd, 4 ° C, zoals beschreven in "Gedetailleerde Protocol". Cellen werden snel opgewarmd tot 37 ° C en gedurende 10 ', 37 ° C. Residuele biotine werd uitgekleed door het verminderen, werden de cellen gelyseerd en gebiotinyleerde eiwitten werden geïsoleerd door streptavidine-affiniteitschromatografie. De immunoblot toont totale oppervlakte DAT op t = 0 (T), strip controle (S), en geïnternaliseerd DAT (I). Let op de zichtbare band in de strip controle laan, wijzen op een slechte strip efficiency.

Discussion

Vaak voorkomende problemen: Het meest voorkomende probleem dat zich voordoet in deze experimenten is slecht strip efficiency. De efficiëntie van de strip is van cruciaal belang in de mogelijkheid om de resultaten te interpreteren. Tenzij de strip was zeer efficiënt, is het niet mogelijk te concluderen dat elke gebiotinyleerde eiwitten in de internalisatie lanen waren in feite, geïnternaliseerd van het oppervlak. Strips ≥ 90% rendement zijn optimaal, en wij gooi alle resultaten als de strip een lager niveau. Een voorbeeld van een slechte strip wordt weergegeven in figuur 3. Merk op dat de band in de strip baan is goed zichtbaar, en komt overeen met een strook rendement van 34%. Als een slechte strip efficiëntie optreden, kunnen verse TCEP niet direct zijn gemaakt voorafgaand aan toe te voegen aan de cellen. Als alternatief kan de TCEP worden afgebroken en nieuwe reagens zal moeten worden aangeschaft. Gebruik van TCEP poeder, in plaats van oplossing kan omzeilen dit probleem.

Eventuele wijzigingen: In het huidige rapport, meten we een relatieve DAT internalisatie tarief, genomen in de loop van de eerste 10 minuten van internalisatie, en deze vergeleken met de DAT-internalisatie tarief tijdens de PKC-activering. Als alternatief kan een absoluut percentage gemeten worden door de opwarming cellen voor het verhogen van de tijd punten. Hoewel dit kan mogelijk zijn, onze ervaring leert dat het lage signaal niveaus in de vroege tijdstippen, in combinatie met inter-experimentele variabiliteit, niet zeer reproduceerbare resultaten op te leveren op zeer vroege tijdstippen. Ook, hoewel we gebruikt hechtende cellen, kan de test worden aangepast voor celsuspensies. Tissue suspensies, zoals synaptosomes, kan ook worden gebruikt. Echter, is het noodzakelijk dat de integriteit van de membranen eerste is gevestigd. Indien het preparaat heeft een aanzienlijk percentage van de "lekkende" membranen, zal de biotinylatie reagens label intracellulaire eiwitten en het zal niet mogelijk om een ​​betrouwbare bepalen de endocytische tarief. In deze situatie moet immunoblots ook gezocht worden voor een intracellulaire marker eiwit, zoals actine, om te testen of het intracellulaire eiwit-pool werd blootgesteld aan de biotinylatie reagens.