Mätning Plasma membranprotein Endocytic priser genom reversibel Biotinylation

Summary

Reglerad endocytos styr cellens nivåerna ytan uttryck för majoriteten av membranproteiner. Här använder vi reducera, membran impermeant biotinylation reagenser för att mäta endocytic hastighet av dopamin transportören (DAT), en polytopic membranprotein. Metoden möjliggör en okomplicerad metod för att mäta endocytic andelen flesta plasma membranproteiner.

Abstract

Plasma membranproteiner är ett stort och mångskiftande grupp av proteiner som består av receptorer, jonkanaler, transportörer och pumpar. Aktiviteten hos dessa proteiner är ansvarig för en rad viktiga cellulära händelser, bland annat näringstillförsel, cellulär retbarhet och kemiska signalering. Många plasma membranproteiner är dynamiskt regleras av endocytic människohandel, som modulerar proteiners funktion genom att förändra uttrycket protein yta. De mekanismer som underlättar protein endocytos är komplexa och inte helt klarlagda för många membranproteiner. För att till fullo förstå de mekanismer som styr endocytic handel med ett visst protein är det viktigt att proteinet är endocytic hastighet exakt mätas. För många receptorer, är direkta endocytic takt mätningar ofta uppnås utnyttja märkt receptor ligander. Men för många klasser av membranproteiner, exempelvis transportörer, pumpar och jonkanaler, det finns ingen praktisk ligand som kan användas för att mäta endocytic takt. I denna rapport beskriver vi en reversibel biotinylation metod som vi använder för att mäta dopamin transportören (DAT) endocytic kurs. Denna metod ger en enkel metod för att mäta internalisering priser, och kan lätt användas för handel studier av de flesta membranproteiner.

Protocol

Förfarande Översikt:

Med hjälp av denna metod är cellytan proteiner kovalent märkt med biotin om tillgängliga extracellulära lysinrester med ett membran impermeant, disulfide-kopplad biotinylation reagens (sulfo-NHS-SS-biotin) under handel begränsande villkor (dvs låg temperatur) (se Figur 1. för illustration). En uppsättning av celler flyttas över till människohandel begränsande villkor (37 ° C) och biotinylerad proteiner internalisera. Den andra uppsättningen celler hålls vid låg temperatur som kontroller för 1) den totala ytan protein vid tid = 0, och 2) strippning kontroll. Efter en kort period av internalisering, är cellerna flyttas tillbaka till låg temperatur för att stoppa internalisering, och alla rester av ytan Biotin är klädde av genom att behandla celler med ett reduktionsmedel, som klyver disulfide-kopplade biotin. Biotinylerad proteiner som uppstod från cellytan och var internaliseras skyddas från strippning steg, och kommer att vara den enda biotinylerad proteiner som finns kvar. Efter cellslys är biotinylerad proteiner isolerade med streptavidin affinitetskromatografi och proteinet av intresse upptäcks av kvantitativa immunoblotting. För att bestämma endocytic ränta, är den mängd internaliserade protein jämfört med den totala ytan kontroll märkt vid tiden = 0. Vi har framgångsrikt använt denna metod för att mäta internalisering hastighet av neuronala noradrenalin ¹ och dopamin ^1-4 transportörer.

Detaljerade protokoll:

Dag 1:

1. Tavla celler i 6 brunnar så att de kommer att vara ~ 80% konfluenta dag 2. Alternativt, om transfekterade celler används, transfektera med en täthet så att de kommer att vara ~ 80% confluent vid internalisering räntan kommer att mätas. Om cellerna inte är så starkt anhängare bör vävnadskultur ware behandlas med en cell adhesion substrat (t.ex. poly-D-lysin) för att förhindra cell förlust under det omfattande tvätta steg.
2. För varje protein som ska testas, till tallriken 2 brunnar på en tallrik användas som den totala ytan protein (t = 0) och strippning kontroller. På en andra platta, platta en källa för respektive internalisering kondition testas (dvs basal endocytic takt vs narkotika-behandlad).
3. Förbered följande lösningar och förvara vid den angivna temperaturen för användning på Dag 2:
   • PBS ^{2 +:} Fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4) kompletterat med 1,5 mM MgCl _2, 0,2 mM CaCl _2, (4 ° C)
   • Biotinylation Quench Lösning: PBS ^{2 +} kompletteras med 100 mm glycin, (4 ° C)
   • NT buffert: 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0,2% BSA, 20 mM Tris, pH 8,6, (4 ° C)
   • RIPA buffert: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0,1% SDS, 1,0% Triton X 100, 1,0% natriumdeoxikolat, (4 ° C)
   • Sulfo-NHS-SS-biotin stamlösning: Lös i dimetylsulfoxid (DMSO) till 200 mg / ml (-20 ° C)
   • Tris (2-carboxyethyl) fosfin hydroklorid (TCEP) stamlösning: 500 mm H ₂ O, (-20 ° C, täckt i folie för att blockera ljus)

Dag 2:

1. Förbered PBS ^{2 +} kompletteras med 0.18g/ml glukos, 0,2% IgG / proteas-fri bovint serumalbumin (PBS ^{2 +} / g / BSA). Förvärma lösningen till 37 ° C i vattenbad.
2. Tina ut sulfo-NHS-SS-biotin stamlösning på bänken toppen att smälta DMSO. Omedelbart före användning, bered nya sulfo-NHS-SS-biotin-lösning (2,5 mg / ml i iskallt PBS ^{2 +,} tillräckligt för 0,75 ml / brunn). Vortex lösningen kraftigt för att löses i DMSO. Observera att NHS-biotin reagens är lätt hydrolyseras i vattenlösning. Därför bör alla lösningar skall beredas omedelbart före användning.
3. Biotinylation: Placera plattorna på ett isbad i kylrum och skölj 3 x 2 ml med iskall PBS ^{2 +.} Var säker på att plattorna något är vinklade för att möjliggöra för komplett tömning och bortforsling av buffertlösningen. Tillsätt 0,75 ml / brunn av det färska sulfo-NHS-SS-biotin-lösning i varje brunn. Inkubera x 15 ", 4 ° C på isbad med kraftig omskakning. Efter inkubationen är klar, förbereda en annan färsk sulfo-NHS-SS-biotin-lösning. Ersätta den gamla lösningen med färsk lösning och inkubera x 15 ", 4 ° C.
4. Släckning: Det är viktigt att alla icke-reagerande NHS-biotin molekyler är släckt, så att de inte kommer att reagera med och biotinylate intracellulära proteiner när cellerna lyseras. Tvätta cellerna 3 x 2 ml med härdning lösning och inkubera två gånger i 2 ml släcka lösning x 15 ", 4 ° C med varsam skakning.
5. Internalisering: Om läkemedelsbehandling testas, lägg på narkotika koncentration till PBS ^{2 +} / g / BSA. Håll koll plattan vid 4 ° C och ta internalisering platta ut ur kylrummet. Tvätta 3 x 2 ml med förvärmda PBS ^{2 +} / g / BSA (+ / - DRUGS) och lämna in samma lösningar (2 ml / brunn). Fyll alla tomma brunnar med förvärmda lösning för att säkerställa jämn temperatur över hela plattan. Överför cellerna till en 37 ° C inkubator för 10 ". Omedelbart före slutet av 37 ° C inkubering, bered nya 50 mM TCEP lösning i NT buffert som ska användas för strippning steg och förvara på is. Förbered tillräckligt belopp för 1,0 ml / brunn.
6. Strippa: Överför omedelbart skylt (ar) till isbad och återvända till kylrum. Snabbt tvätta cellerna med iskall NT buffert, 3 x 2 ml för att stoppa endocytos. Också tvätta band kontrollbrunnarna 3 x 2 ml med NT buffert. Tillsätt 1,0 ml färsk strippa lösning till varje brunn. Inkubera på is, 15 ', 4 ° C med varsam skakning. Byt brunnar med färska strippning lösning och inkubera ytterligare 15 ', 4 ° C på is.
7. Lys: Tvätta alla brunnar som var utsatta för strippning lösning, 3 x 2 ml NT buffert. Tvätta sedan alla brunnar (även totalt kontroller) med 3 x 2 ml PBS ^{2 +.} Lyse i 300μl/well RIPA buffert (eller andra lyseringsbuffert kompatibel för proteinet av intresse) som innehåller färska proteashämmare (1,0 mm PMSF, 1,0 mikrogram / ml vardera leupeptin, aprotinin och pepstatin). Lyse genom att skaka x 20 ", 4 ° C. Transfer till mikrofugrör rör och tydliga cellulära skräp genom att centrifugera 18.000 xg, 10 ', 4 ° C.
8. Protein koncentration beslutsamhet: Använd ett protein assay kompatibel med din lys tillstånd (t ex DC protein assay, Bio-Rad) att fastställa proteinets koncentration av lysates jämfört med en vanlig BSA kurva.
9. Streptavidin affinitetskromatografi: Förbered mikrofugrör rör med motsvarande mängder protein för varje prov. Lägg lyseringsbuffert att få den slutliga volymen av varje prov som 200μl. Vortexa streptavidin agarosen pärlor kraftfullt för att få till en jämn suspension. Med hjälp av en 200μl pipett med spetsen avskuren, pipett pärlor i varje rör. Rekommenderad 20μl beads/50 mikrogram lysat. Inkubera över natten, 4 ° C på ett rör rotator.

Dag 3:

1. Bead tvätt: Centrifugera prover, 18.000 xg, 2 'för att samla pärlor. Aspirera av lysat, försiktigt så att inte närma pärla pellets med aspirator. Använd en plast pipettspets i änden av dammsugaren för bättre kontroll. Tillsätt 0,75 ml buffert lys till varje rör, och vortexa att tvätta pärlor. Centrifugera prover, 18.000 xg, 2 'att samla pärlor och upprepa aspiration och tvätta två gånger (tre tvättar totalt). Efter den sista tvätten, aspirera så mycket av bufferten som möjligt utan att störa pärla pelleten. Tipping röret mot dammsugaren bistår med detta steg.
2. Exempel eluering: Lägg 20-25μl 2x Laemmli prov buffert (minska) till varje rör. Den reduktionsmedel kommer klyva NHS-SS-biotin disulfide obligationer, släppa den isolerade proteiner i lösning. De flesta membranproteiner är mycket känsliga för aggregering när kokt, och bör inte värmas upp innan de lastas geler för SDS-PAGE. Bestäm värme känslighet ditt protein av intresse innan du utför dessa experiment. Om proteinet inte kan tolerera kokning / uppvärmning, inkubera på en rotator, 30 ', rumstemperatur före analys med SDS-PAGE. Detta är tillräckligt för att klyva disulfid obligationen och eluera proteiner.
3. SDS-PAGE och Immunoblotting: Separat proteiner med SDS-PAGE. För varje prov är det enklast att köra prover i följande ordning: total yta (tid = 0), band, internalisering skick # 1, skick # 2, etc. Transfer till membran för immunoblotting och blot med lämplig antikropp för ditt protein av intresse. Fånga immunoreaktiva band med hjälp av en CCD-kamerasystem gel dokumentation, är säker på att det inte finns några mättade pixlar. Kvantifiera varje band densitet med hjälp av gel analys / densitometri programvara.

Representativa resultat:

En representant immunoblot Resultatet visas i figur 2A. Den starkaste signalen i "total" Lane (T), som är totala ytan protein före internalisering. De "band"-kontroll (S) bör helst vara nära tomt, som visar att remsan var effektiv för experimentet. Remsan effektivitet beräknas genom att jämföra tätheten av "band" körfält för att den "totala" Lane (t.ex. protein som biotinylerad parallellt med band, men var varken värmas upp till 37 ° C eller utsatta för strippning lösning). Följande formel används:

[1 - (band / totalt)] * 100%

Med denna formel var remsan i figur 2 99,8% effektiv. Slutligen kommer du att se band av mindre intensitet än den totala i internaliseringen Lane (ar) (I). I exemplet (figur 2), behandlades celler behandlades med antingen fordon eller 1μM phorbol myristate acetat (PMA) under en 10 "internalisering och dopamin priser transportör internalisering mättes under en 10 ursprungliga internalisering period. Internalisering beräknas somföljande:

internaliserade / totalt * 100

Som framgår av Figur 2B, 10,4% yta DAT internaliserat under 10 "under fordonet behandlade förhållanden. PMA behandling ökat DAT internalisering priser till 23,2% av det totala ytan DAT.

Figur 1. Protokollet visar. Celler är biotinylerad vid 4 ° C enbart för att märka ytan befolkningen, och flyttas till 37 ° C för att initiera internalisering. Efter internalisering, är celler snabbt kylas för att stoppa endocytic processer och kvarvarande yta biotin skalas genom att behandla celler med reduktionsmedel. Den enda biotinylerad proteiner som finns kvar är de som uppstod från ytan vid t = 0 och var internaliseras, vilket skyddar dem från strippa behandlingen. Biotinylerad proteiner är isolerade av parti affinitetskromatografi med streptavidin pärlor och proteinet av intresse upptäcks av immunoblotting.

Figur 2. PKC aktivering ökar DAT endocytic takt. Internalization analys. PC12 cellerna stabilt uttrycker DAT var biotinylerad, 4 ° C som beskrivs i "Detaljerade protokoll". Celler snabbt värmas upp till 37 ° C ± 1 mikroM PMA och inkuberas 10 ", 37 ° C. Kvarvarande biotin blev avklädd genom att minska, var celler lyseras och biotinylerad proteiner var isolerade av streptavidin affinitetskromatografi. (A) representant immunoblot visar total yta DAT vid t = 0 (T), remsor kontroll (S), och internaliserad DAT (I) enligt de angivna villkoren. (B) Band fångades med en CCD-kamera och kvantifieras med mängduppgifter programvara (Bio-Rad). Data är uttryckt som% totala DAT internalized/10 min.

Figur 3. Exempel immunoblot skildrar en fattig biotin remsa. Internalization analys. PC12 cellerna stabilt uttrycker DAT var biotinylerad, 4 ° C som beskrivs i "Detaljerade protokoll". Celler snabbt värmas upp till 37 ° C och inkuberas 10 ", 37 ° C. Kvarvarande biotin blev avklädd genom att minska, var celler lyseras och biotinylerad proteiner var isolerade av streptavidin affinitetskromatografi. Den immunoblot visar totala ytan DAT vid t = 0 (T), remsor kontroll (S), och internaliserad DAT (I). Notera synliga bandet i remsan kontroll körfält, ett tecken på dålig band effektivitet.

Discussion

Vanliga problem: Det vanligaste problemet som uppstår i dessa experiment är dålig band effektivitet. Effektiviteten av remsan är avgörande i att kunna tolka resultaten. Om inte remsan var mycket effektiv, är det inte möjligt att dra slutsatsen att någon biotinylerad proteiner i internaliseringen körfält var i själva verket internaliserade från ytan. Strips ≥ 90% effektivitet är optimala och vi kasta några resultat om remsan sjunker under denna nivå. Ett exempel på ett dåligt band visas i figur 3. Notera att bandet i remsan körfält är ganska synliga, och motsvarar en remsa verkningsgrad på 34%. Om dåliga band effektivitet inträffar kan färska TCEP inte har gjorts omedelbart innan du lägger till cellerna. Alternativt kan TCEP brytas ned och nya reagens måste köpas. Användning av TCEP pulver, snarare än lösning kan kringgå detta problem.

Möjliga ändringar: I den aktuella rapporten, mätte vi en relativ DAT internalisering ränta, tagit över loppet av de första 10 minuterna av internalisering, och jämfört den med DAT internalisering takt under PKC aktivering. Alternativt kan en absolut hastighet mätas genom uppvärmningen celler för att öka tidpunkter. Även om detta kan vara möjligt, visar vår erfarenhet att de låga signalnivåer vid tidig time-poäng, tillsammans med inter-experimentella variabilitet, inte ger highly reproducerbara resultat vid mycket tidig time-poäng. Dessutom, även om vi använde anhängare celler, kan analysen modifieras för cellsuspensioner. Tissue suspensioner såsom synaptosomes, kan också användas. Det är dock viktigt att integritet membranen första är etablerad. Om preparatet har en betydande andel av "läckande" membran, kommer biotinylation reagensen etiketten intracellulära proteiner och det kommer inte att vara möjligt att tillförlitligt bestämma endocytic takt. I denna situation bör immunoblots också sonderade för en intracellulär markör protein, såsom aktin, att testa om det intracellulära proteinet poolen var utsatt för biotinylation reagens.