Summary
규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.
Abstract
플라즈마 막 단백질은 수용체, 이온 채널, 전송기 및 펌프로 구성된 단백질 많은 다양한 그룹입니다. 이 단백질의 활동이 양분 전달, 세포 흥분, 화학 신호를 포함한 주요 세포 행사의 다양한 책임이 있습니다. 대부분의 플라스마 막 단백질은 동적 단백질 표면 표현을 변경하여 단백질 기능을 modulates endocytic 인신 매매에 의해 규제됩니다. 단백질 endocytosis를 촉진 메커니즘은 복잡하며 충분히 많은 막 단백질에 대한 이해되지 않습니다. 완전히 주어진 단백질의 endocytic 밀매를 제어하는 메커니즘을 이해하기 위해서는 단백질의 endocytic 속도가 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 많은 수용체에 대한 직접 endocytic 속도 측정이 자주 표시 수용체 리간드를 활용 달성하고 있습니다. 그러나, 전송기, 펌프와 이온 채널과 같은 막 단백질의 여러 클래스에 대한, endocytic 속도를 측정하는 데 사용할 수있는 편리 리간드가 없습니다. 현재 보고서에서, 우리는 도파민 수송 (DAT) endocytic 속도를 측정하기 위하여 고용 가역 biotinylation 방법을 설명합니다. 이 방법은 국제화 속도를 측정하는 간단한 방법을 제공하며, 쉽게 대부분의 막 단백질의 밀매 연구에 대한 고용 수 있습니다.
Protocol
절차 개요 :
이 방법을 사용하여, 세포 표면 단백질은 covalently (그림 참조 1. 인신 매매 제한 조건 (즉, 낮은 온도)에서 막 impermeant, 이황화 결합 biotinylation 시약을 (sulfo - NHS - SS - 비오틴)를 사용하여 사용 가능한 세포 리신 잔류물에 비오틴과 레이블 아르 그림에 대한). 세포 중 하나 세트 매매 허용 조건 이동 (37 ° C)와 biotinylated 단백질 internalize입니다. 세포의 다른 집합 시간 = 0 1)의 전체 표면 단백질, 그리고 2) 스트립 컨트롤에 대한 컨트롤로 저온에서 보관됩니다. 국제화의 짧은 기간에 따라, 세포가 내면화을 막을 저온으로 이동하고, 잔여 표면 비오틴은 이황화 결합 비오틴을 클리브스 감소 요원과 세포를 치료에 의해 해제 벗겨지고 있습니다. 세포 표면에서 발생한 및 internalized되었습니다 Biotinylated 단백질은 스트립 단계에서 보호하고 있으며, 남아있는 유일한 biotinylated 단백질 것입니다. 세포 용해 후, biotinylated 단백질은 streptavidin 친화도 크로마 토그래피에 의해 고립되고 관심의 단백질은 양적 immunoblotting에 의해 감지됩니다. endocytic 속도를 확인하려면, internalized 단백질의 양은 시간이 = 0에 표시된 전체 표면 제어 비교됩니다. 우리는 성공적으로의 연결을 norepinephrine 1 도파민 1-4 전송기의 국제화 속도를 측정하는이 방법을 사용했습니다.
상세 프로토콜 :
1 일 :
- 그들은 일 2 ~ 80 %의 합류한다는 등 6 접시에 잘 플레이트 세포. 또는, transfected 세포를 사용하고있다면, 그들은 국제화 속도가 측정되는 시간 ~ 80 %의 합류됩니다 같은 밀도에서 transfect. 세포가 강력하게 자기편하지 않는 경우, 조직 문화 도자기는 광범위한 세척 단계 동안 세포 손실을 방지하기 위해 세포 부착 기판 (예 : 폴리 - D - 라이신)와 함께 치료를해야합니다.
- 각각의 단백질이 테스트되고 들어, 하나의 접시에 번호판이 우물은 전체 표면 단백질 (T = 0)와 스트립 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 두 번째 접시에, 테스트중인 각각의 국제화 조건에 대해 잘 플레이트 한 (즉, 기초 endocytic 속도 대 약물 치료).
- 일 2 사용하기 위해 지정된 온도에서 다음과 같은 솔루션 및 상점 준비 :
- PBS 2 + : 인산 1.5 MM MgCl 2, 0.2 MM CaCl 2, (4 ° C)과 보충 (산도 7.4) 살린 버퍼
- Biotinylation는 솔루션 끄지 : PBS 2 + 100 MM 글리신 (4 ° C)와 보충
- NT 버퍼 : 150 MM NaCl, 1.0 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.2 % BSA, 20 MM 트리스, 산도 8.6 (4 ° C)
- 리파 버퍼 : 10 MM 트리스, 산도 7.4, 150 MM NaCl, 1.0 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % SDS, 1.0 % 트리톤 X 100, 1.0 %의 나트륨 deoxycholate (4 ° C)
- Sulfo - NHS - SS - 비오틴 주식 솔루션 : 200 MG / ML (-20 ° C)에 (DMSO) dimethylsulfoxide에서 디졸브
- 트리스 (2 - Carboxyethyl) phosphine 하이드로 클로라이드 (TCEP) 재고 솔루션 : H 2 O 500 MM (-20 ° C, 빛을 차단하는 호일로 덮여)
일 2 :
- PBS 2 + 0.18g/ml 포도당과 보충, 0.2 % IgG / 프로 테아제 무료 소 혈청 알부민 (PBS 2 + / g / BSA). 준비 ° C 물 목욕에서 37 미리 따뜻한이 솔루션입니다.
- DMSO을 녹일 벤치 위에 sulfo - NHS - SS - 비오틴 주식 솔루션을 누그 러 뜨 리다. 사용하기 바로 전에, 신선한 sulfo - NHS - SS - 비오틴 솔루션 (2.5 얼음 차가운 PBS 2 +, 0.75에 대한 충분한 ML / 음에 MG / ML) 준비합니다. DMSO를 solubilize하기 위해 적극적으로 소용돌이 솔루션입니다. NHS - 비오틴 시약이 수용액에서 쉽게 분해됩니다. 따라서, 모든 솔루션은 사용하기 전에 바로 준비를해야합니다.
- Biotinylation : 플레이스 추운 방에 얼음 욕조에 접시와 얼음 차가운 PBS 2 3 X 2 ML을 씻어 +. 접시가 약간 완전한 배수 및 버퍼 솔루션의 제거를 허용하기 위해 직각 것을 확신한다. / 잘 각 잘 수있는 신선한 sulfo - NHS - SS - 비오틴 솔루션의 0.75 ML을 추가합니다. 부화 X 15 ', 4 명이 활발한 흔들림으로 얼음 욕조에 C. 배양이 완료되면, 또 다른 신선한 sulfo - NHS - SS - 비오틴 솔루션을 준비합니다. 신선한 솔루션 및 부화 X 15 ', 4 ° C.와 함께 기존 솔루션을 대체
- 담금질 : 그들이 함께 반응하고 세포 lysed되면 세포내 단백질을 biotinylate 않도록 모든 비 반응 NHS - 비오틴 분자가 침묵하는 중요한 IT합니다. 칭 솔루션 세포에게 3 X 2 ML 씻으십시오 2 ML의 담금질 솔루션 X 15 ', 4 명이 부드러운 잡고 C 두 번 품어.
- 국제화 : 약물 치료가 테스트되고있다면, PBS 2 + / g / BSA 적절한 약물 농도를 추가합니다. 4 ° C에서 컨트롤 플레이트를 유지하고 국제화 플레이트 차가운 방에서 가지고. 사전 예열 PBS 2 3 X 2 ML 씻으 + / g / BSA (+ / - 박사동일한 솔루션 (2 ML / 음)에 UGS)와 두십시오. 접시에 걸쳐도 온도를 보장하기 위해 미리 예열 솔루션으로 모든 빈 우물을 입력합니다. 10 '에 대한 37 ° C 배양기에 세포를 전송합니다. 37 종료 즉시 이전 ° C 부화, 얼음 스트립 단계 및 저장을 위해 사용되는 NT 버퍼의 신선한 50 MM의 TCEP 솔루션을 준비합니다. 1.0 ML / 음에 대한 충분한 양의를 준비합니다.
- 스트립 : 얼음 욕조와 차가운 방으로 다시 즉시 전송 플레이트 (S). 신속 얼음 차가운 NT 버퍼, 3 세포를 씻어 endocytosis를 중지 X 2 ML. 또한 NT 버퍼와 스트립 제어 우물 3 X 2 ML 씻는다. 각 물론 1.0 ML 신선한 잎을 솔루션을 추가합니다. 부드러운 잡고, 얼음 15 ', 4 ° C를 품어. 신선한 스트립 솔루션 우물을 교체하고 얼음에 추가 15 ', 4 ° C를 품어.
- 용해 : 스트립 솔루션, 3 X 2 ML NT 버퍼에 노출된 모든 우물을 씻으십시오. 다음 3 * 2 ML PBS 2 + 모든 우물 (총 컨트롤 포함) 씻으십시오. 신선한 테아제 억제제 (1.0 MM PMSF, 1.0 μg / ML 각 류펩틴, aprotinin과 pepstatin)이있는 300μl/well 리파 버퍼 (또는 관심의 단백질에 대한 호환 가능한 다른 용해 버퍼)에 Lyse. X 20 ', 4 ° C.를 흔들어하여 Lyse 18,000 XG, 10 ', 4 ° C.를 centrifuging하여 microfuge 튜브 맑은 세포 부스러기로 전송
- 단백질 농도 결정 : 표준 BSA 곡선에 비해 lysates의 단백질 농도를 결정하여 용해 조건 (예 : DC 단백질 분석, 바이오 래드)와 호환되는 단백질 분석을 사용합니다.
- Streptavidin 친화도 크로마 토그래피 : 각 시료에 대해 동일한 양의 단백질과 microfuge 튜브를 준비합니다. 200μl 각 샘플의 최종 볼륨을 가지고 용해 버퍼를 추가합니다. 소용돌이 streptavidin 아가로 오스 비즈 최선을 다해도 중지 가지고 있습니다. 끝에있는 200μl pipettor을 사용하면 각각의 튜브에, 피펫 비즈를 잘라. 20μl beads/50 μg의 lysate를 추천. 튜브 회전에서 하룻밤, 4 ° C를 품어.
3 일 :
- 비드 세척 : 원심 분리기 샘플, 18000 XG 2 '구슬을 수집합니다. 흡인기로 비드 펠렛 접근하지 않도록주의하고, lysate를 대기음. 더 나은 컨트롤에 대한 흡인기의 끝에 플라스틱 피펫 팁을 사용합니다. 0.75 ML의 용해 각각의 튜브에 버퍼, 그리고 구슬을 씻어 와동을 추가합니다. 원심 분리기 샘플, 18000 XG 2 '구슬과 반복 뜻을 수집하고 (총 세 세척) 두 번 세탁합니다. 최종 세척 후, 비드 펠렛을 방해하지 않고 가능한 버퍼만큼 대기음. 흡인기쪽으로 튜브를 티핑하면이 단계 지원합니다.
- 샘플 용출 : 각 튜브 20 - 25μl 2X Laemmli 샘플 버퍼 (감소)를 추가합니다. 감소 에이전트 솔루션으로 분리된 단백질을 방출 클리브는 NHS - SS - 비오틴의 이황화 결합합니다. 대부분의 멤브레인 단백질이 삶은 때 집계에 매우 취약하며, SDS - PAGE를위한 젤에 로딩하기 전에 가열해서는 안됩니다. 이러한 실험을 수행하기 전에 관심의 단백질의 열 감도를 확인합니다. 단백질 / 끓는 난방을 용인할 수 없다면, SDS - PAGE로 분석하기 전에 회전, 30 ', 실온에서 알을 품다. 이것은 클리브 이황화 결합에 충분하고 단백질을 elute.
- SDS - PAGE과 immunoblotting : SDS - PAGE에 의해 분리 단백질. 각 샘플은 다음 순서로 샘플을 실행하는 가장 쉬운 방법을입니다 단백질에 적합한 항체와 함께 총 표면 (시간 = 0), 스트립, 국제화 조건 # 1, 조건 # 2, 등등 immunoblotting을 위해 막에 전송하고 얼룩 관심. 더 포화 픽셀이 없다는 것을 확신하고, CCD 카메라 겔 문서 시스템을 사용 immunoreactive 밴드를 캡처합니다. 겔 분석 / densitometry 소프트웨어를 사용하여 각 밴드 밀도를 계량.
대표 결과 :
대표 immunoblot 결과는 그림 2A에 표시됩니다. 강한 신호는 이전에 내면화하는 표면 단백질의 총 금액은 "총"레인 (T)에 있습니다. "스트립"제어 (S)는 이상적인 스트립이 실험을 위해 효율적인 것을 보여줍니다 공백에 가까이해야합니다. 스트립 효율성은 "총"차선의에있는 '스트립'차선의 밀도를 비교하여 계산 (스트립과 병렬로 biotinylated되었다 예 : 단백질,하지만 둘 다 37 ° C로 예열하지 않고 스트립 솔루션에 노출되었습니다.) 다음과 같은 공식이 사용됩니다 :
[1 - (스트립 / 총)] * 백퍼센트
이 수식을 사용하여, 그림 2의 스트립은 99.8 % 효율되었다. 마지막으로, 당신은 국제화 차선의 총 (S) (I)보다 낮은 강도의 밴드를 볼 수 있습니다. 예를 들어 (그림 2)에서 치료 세포가 차량 또는 10 중에 1μM phorbol myristate 아세테이트 (PMA) 중 하나와 함께 치료를했다 초기 국제화 시대 '국제화와 도파민 전송 국제화 요금은 10 측정되었다. 국제화 속도로 계산됩니다다음 :
합계 / internalized * 100
그림 2B에서 본, 10.4 % 표면 DAT는 차량 처리 조건에서 10 '이상 internalized. PMA 치료 총 표면 DAT의 23.2 %에 DAT의 국제화 속도를 향상시켰습니다.
그림 1. 프로토콜 일러스트 레이션. 전지 4 biotinylated 아르 ° C가 독점적으로 표면 인구 라벨, 37으로 이동 아르 ° C 국제화를 시작합니다. 국제화에 따라, 세포가 빠르게 endocytic 프로세스와 잔여 표면 비오틴를 중지 추위 것은 줄이고 요원과 세포를 치료에 의해 분해까지입니다. 남아있는 유일한 biotinylated 단백질은 t = 0의 표면에서 발생한 및 internalized 있었다 따라서 스트립 치료에서 그들을 보호하시는 분들입니다. Biotinylated 단백질은 streptavidin 비즈와 함께 배치 친화도 크로마 토그래피에 의해 고립되고 관심의 단백질은 immunoblotting에 의해 감지됩니다.
그림 2. PKC의 활성화는 DAT endocytic 속도를 증가시킵니다. 내면화 분석은. 안정 DAT 표현 PC12 세포는 biotinylated, 4 ° C로 "상세 프로토콜"에 설명되어 하였다. 전지는 급속하게 37 기까지했다 ° C ± 1 μm의 PMA와 incubated 10 '37 ° C. 나머지 비오틴은 줄임으로써 뺏겼어요, streptavidin 친화도 크로마 토그래피에 의해 세포 lysed되었고 biotinylated 단백질은 고립되었다. (A) 대표 immunoblot 총 표면 DAT를 보여주는 t에서 = 0 (T), 스트립 제어 (S), 그리고 지정된 조건 하에서 internalized DAT (I). (B) 밴드는 CCD 카메라로 캡처한 및 수량 데이터 소프트웨어 (바이오 래드)와 계량되었습니다. 데이터는 %의 총 DAT internalized/10의 분으로 표현됩니다.
그림 3. 예 immunoblot는 가난한 비오틴의 스트립. 내면화 분석을 묘사한. 안정 DAT 표현 PC12 세포는 biotinylated, 4 ° C로 "상세 프로토콜"에 설명되어 하였다. 전지는 급속하게 37 기까지했다 ° C와 incubated 10 '37 ° C. 나머지 비오틴은 줄임으로써 뺏겼어요, streptavidin 친화도 크로마 토그래피에 의해 세포 lysed되었고 biotinylated 단백질은 고립되었다. immunoblot 총 표면 DAT를 보여줍니다 t = 0에서 (T), 스트립 제어 (S), 그리고 internalized DAT (I). 가난한 스트립 효율을 나타내는 스트립 제어 차선에서 보이는 밴드를합니다.
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Discussion
일반적인 문제 :이 실험에서 발생하는 가장 일반적인 문제는 가난한 스트립의 효율성이다. 스트립의 효율 결과를 해석하는 수있는에 중요합니다. 스트립은 매우 효율적인 게 아니라면, 그것은 국제화 차선에 biotinylated 단백질의 표면에서 internalized 사실에 있다고 결론하는 것은 불가능합니다. 스트립 ≥ 90 % 효율이 최적이며, 스트립이 수준 아래로 떨어지면면 우리는 어떤 결과를 폐기하십시오. 가난한 스트립의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 스트립 차선에있는 밴드가 꽤 볼, 34 %의 스트립 효율에 해당합니다. 가난한 스트립 효율이 발생하면, 신선한 TCEP 전에 세포에 추가 바로 만든되지 않았을 수 있습니다. 또는 TCEP가 타락 수와 새로운 시약은 구입해야합니다. TCEP 가루를 사용하면, 오히려 솔루션보다,이 문제를 우회 수 있습니다.
가능한 수정 : 현재 보고서에서, 우리는 국제화의 초기 10 분 과정을 점령 상대 DAT의 국제화 속도를 측정하고, PKC 활성 동안 DAT의 국제화 속도에 비해. 또한, 절대적인 요금은 시간이 지점을 높이기위한 온난 화 세포로 측정 수 있습니다. 이 가능할 수도 있지만, 우리의 경험이 상호 실험 변화와 결합 시간이 지점 초기에 낮은 신호 레벨, 시간이 점을 매우 초기에 높은 재현성 결과를 얻을하지 않는 것이 좋습니다. 우리가 자기편 세포를 사용하지만 또한, 분석은 세포 suspensions에 대해 수정할 수 있습니다. 같은 synaptosomes 같은 조직 suspensions은 또한 사용될 수있다. 그러나, 그것은 세포막의 무결성가 처음 설립되어 필수적입니다. 준비는 "새는"세포막의 중요한 비율이있다면, biotinylation 시약은 세포 내 단백질에 라벨을하고 그것은 endocytic 속도를 안정적으로 확인할 수 없습니다. 이 상황에서는, immunoblots 또한 세포내 단백질 수영장이 biotinylation 시약에 노출되었는지 테스트하는 등 굴지으로 세포 마커 단백질에 대한 탐지해야합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 # DA15169 앙에 NIH 교부금에 의해 투자되었다
References
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