Summary
Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.
Abstract
Plazma zarı proteinleri, reseptörler, iyon kanalları ve pompaları oluşan proteinlerin büyük bir, çeşitli grup. Faaliyet bu proteinlerin besin teslimat, hücresel heyecanlanma, kimyasal ve sinyalizasyon dahil olmak üzere önemli hücresel olayları, çeşitli sorumludur. Birçok plazma zarı proteinleri protein yüzey ekspresyonunu değiştirerek protein fonksiyonu modüle endositik kaçakçılığı, dinamik tarafından düzenlenir. Protein endositoz kolaylaştıracak mekanizmalar karmaşıktır ve birçok membran proteinlerinin tam olarak anlaşılmış değildir. Verilen bir protein endositik kaçakçılığı kontrol mekanizmaları tam olarak anlamak için, protein endositik oranı tam olarak ölçülebilir kritik öneme sahiptir. Birçok reseptörleri için doğrudan endositik hızı ölçümleri sıklıkla etiketli reseptör ligandlar kullanılarak elde edilir. Ancak, taşıyıcılar, pompalar ve iyon kanalları gibi birçok sınıflar, membran proteinlerinin, endositik hızını ölçmek için kullanılabilir uygun ligand var. Bu raporda, dopamin taşıyıcısı (DAT) endositik oranını ölçmek için kullandıkları bir geri dönüşümlü biyotinilasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, içselleştirme oranlarını ölçmek için basit bir yaklaşım sağlar ve kolay bir çoğu membran proteinlerinin kaçakçılığı çalışmaları için istihdam edilebilir.
Protocol
Usul Genel Bakış:
Bu yaklaşımı kullanarak, hücre yüzey proteinleri kovalent (bkz. Şekil 1 kaçakçılığı kısıtlayıcı koşullar (düşük sıcaklık) altında bir Membran geçirgenliği olmayan, disülfit çiftli biyotinilasyon reaktifi (sulfo-NHS-SS-biotin) kullanarak ekstrasellüler lizin kalıntılarının biotin ile etiketlenir örnek olması için). Bir hücre kümesi kaçakçılığı izin şartlarına kaymıştır (37 ° C) ve biotinlenmiş proteinler içselleştirmek. Hücre 1) süresi = 0 toplam yüzey protein, ve 2) sıyırma kontrolü için kontrol olarak düşük ısıda tutulur. Içselleştirilmesi kısa bir süre sonra, hücreleri içselleştirilmesi durdurmak için düşük sıcaklık geri kaydırılır ve herhangi bir kalıntı yüzey biotin disülfit çiftli biotin parçalayarak indirgeyici bir ajan, hücreleri tedavi çıkardı. Biotinlenmiş proteinler hücre yüzeyinde ortaya çıkan ve içselleştirilmiş sıyırma adım korunur ve kalan tek biotinlenmiş proteinler olacaktır. Hücre parçalama, biotinlenmiş proteinler streptavidin afinite kromatografisi ile izole edilir ve ilgi protein kantitatif immunoblotting tarafından algılanır. Endositik oranını belirlemek için, içselleştirilmiş protein miktarı, süresi = 0 etiketli toplam yüzey kontrol etmek için karşılaştırılır. Biz başarıyla nöronal norepinefrin 1 ve dopamin 1-4 taşıyıcılar içselleştirilmesi hızını ölçmek için bu yaklaşımı kullandık.
Detaylı Protokol:
1. Gün:
- 6 Gün 2 ~ 80% konfluent olacağı gibi iyi plakaları Levha hücreleri. Alternatif olarak, transfekte hücreleri kullanılıyor ise, içselleştirme oranı ölçülecek zaman, ~% 80 konfluent olacak şekilde bir yoğunlukta transfect. Hücrelerin kuvvetle yapışık değilse, doku kültürü eşya geniş yıkama adımları sırasında hücre kaybını önlemek için bir hücre adezyon substrat (örneğin poli-D-lisin) ile tedavi edilmelidir.
- Her protein test için, bir plaka üzerinde plaka 2 kuyu toplam yüzey proteini (t = 0) ve sıyırma kontrolleri olarak kullanılabilir. Ikinci bir plaka üzerinde, test edilen her bir içselleştirme durum için iyi bir plaka (yani bazal endositik uyuşturucu tedavi oranı vs.)
- 2. Gün kullanmak için belirtilen sıcaklıklarda aşağıdaki çözümleri ve mağaza hazırlayın:
- PBS 2 +: Fosfat 1.5 mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl 2 (4 ° C) ile desteklenebilir (pH 7.4) tamponlu salin
- Biyotinilasyon Çözüm Quench: PBS 2 + 100 mM glisin (4 ° C) ile takviye
- NT tampon: 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA,% 0,2 BSA, 20 mM Tris, pH 8.6, (4 ° C)
- RIPA tampon: 10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA,% 0.1 SDS,% 1.0 Triton X 100,% 1.0 sodyum deoksikolatın, (4 ° C)
- Sulfo-NHS-SS-biotin stok solüsyonu: 200 mg / ml (-20 ° C), (DMSO) dimethylsülfoksit içinde çözülür
- Tris (2-Carboxyethyl) fosfin hidroklorür (TCEP) stok solüsyonu: 500 mM H 2 O, (-20 ° C, ışığı engellemek için folyo kaplı)
2. Gün:
- PBS 2 + 0.18g/ml glukoz ile desteklenmiş,% 0.2, IgG / proteaz-sığır serum albumin (PBS 2 + b / g / BSA). hazırlayın Pre-sıcak 37 ° C su banyosunda bu çözüm.
- DMSO eritmek için tezgah üstünde sulfo-NHS-SS-biotin stok solüsyonu çözülme. Hemen önce, taze sulfo NHS-SS-biotin solüsyonu (2,5 mg / ml buz PBS 2 + 0.75 için yeterli ml / iyi) hazırlar. DMSO çözünür şiddetle Vortex çözüm. NHS-biotin reaktif sulu çözüm kolayca hidrolize olduğunu unutmayın. Bu nedenle, tüm çözümlerin kullanımı hemen önce hazırlanmış olmalıdır.
- Biyotinilasyon: Yeri plakaları ve soğuk oda, bir buz banyosu, buz PBS 2 ile 3 x 2 ml durulayın . Plakalar biraz tam drenajı ve tampon çözelti çıkarılması için izin açılı olduğu belirli olun. 0.75 ml / her bir kuyunun taze sulfo-NHS-SS-biotin çözüm ekleyin. Inkübe x 15 ', 4 ° C dinç sallayarak buz banyosu. Inkübasyon tamamlandıktan sonra, başka bir taze sulfo-NHS-SS-biotin çözüm hazırlayın. Taze çözüm ve inkübe x 15 ', 4 ° C ile eski bir çözüm değiştirin.
- Quenching ile reaksiyona ve hücre içi protein hücrelerinin parçalanmış bir biotinylate olmaz, böylece olmayan tüm tepki NHS biotin molekülleri söndürülür kritik. Isıl işlem çözümü ile hücre yıkayın ve 3 x 2 ml 2 ml quench çözüm x 15 ', 4 ° C ile nazik sallayarak iki kez kuluçkaya yatmaktadır.
- İçselleştirme: ilaç tedavileri test ediliyorsa, uygun ilaç konsantrasyonu PBS 2 + b / g / BSA ekleyin. 4 ° C'de kontrol plaka tutun ve içselleştirilmesi plaka soğuk oda çıkarmak. Önceden ısıtılmış PBS 2 ile 3 x 2 ml Yıkama + / g / BSA (+ / - drugs) ve aynı çözümleri (2 ml / iyi) bırakın. Önceden ısıtılmış çözümü ile plaka üzerinde bile sıcaklığını sağlamak için herhangi bir boş kuyu doldurun. 10 ', 37 ° C inkübatör hücrelere aktarın. 37 sonuna kadar hemen önce ° C de inkübasyon, buz üzerinde sıyırma adım ve saklamak için kullanılan NT tampon taze 50 mM TCEP solüsyon hazırlanır. 1.0 ml / kuyu için yeterli miktarda hazırlayın.
- Sıyırma: buz banyosu ve soğuk oda dönmek için hemen transfer plaka (lar). Hücrelerin hızlı bir şekilde buz gibi NT tampon, 3 ile yıkayın endositoz durdurmak için x 2 ml. Ayrıca NT tampon şerit kontrol kuyuları 3 x 2 ml yıkayın. Her kuyuya 1.0 ml taze sıyırma çözüm ekleyin. Nazik sallayarak, 15 ', 4 ° C buz üzerinde inkübe edin. Taze sıyırma çözeltisi ile kuyu değiştirin ve buz üzerinde ek bir 15 ', 4 ° C'de inkübe edin.
- Lizis: sıyırma çözüm, 3 x 2 ml NT tampon maruz kalan tüm kuyuları yıkayın. Sonra tüm kuyuları (toplam kontrolleri de dahil olmak üzere) 3 x 2 ml PBS 2 + yıkayın. 300μl/well RIPA tampon taze proteaz inhibitörleri (1.0 mM PMSF, 1.0 mikrogram / ml her leupeptin, aprotinin ve pepstatin) içeren (veya uyumlu diğer lizis tamponu ilgi protein) Lyse. X 20 ', 4 ° C sallayarak tarafından Lyse 18.000 xg, 10 ', 4 ° C santrifüj mikrofuge'de tüpler ve net hücresel enkaz Transfer
- Protein konsantrasyonunun belirlenmesi: lizis koşulları (örneğin DC protein tayini, Bio-Rad) ile uyumlu bir protein testi standart bir BSA eğrisine göre lizatları protein konsantrasyonu belirlemek için kullanın.
- Streptavidin afinite kromatografisi: Her bir örnek için eşdeğer miktarda protein mikrofuge'de tüpleri hazırlayın . Her numune son hacmi 200μl getirmek için lizis tamponu ekleyin. Vortex streptavidin agaroz boncuk şiddetle hatta süspansiyon getirmek. 200μl ucu ile bir pipet kullanarak her bir tüpe, pipet boncuk kesti. Önerilen 20μl beads/50 mikrogram lizat. Bir tüp rotator gecede, 4 ° C inkübe edin.
3. Gün:
- Boncuk yıkama: Santrifüj örnekleri, 18.000 xg, 2 'boncuk toplamak için. Aspiratör ile boncuk pelet yaklaşım dikkatli olmak, lizat kapalı aspire. Daha iyi kontrol için aspiratör ucunda plastik bir pipet kullanın. Her bir tüp 0.75 ml lizis tampon, boncuk yıkamak için vorteks ekleyin. Santrifüj örnekleri, 18.000 xg, 2 ', boncuk ve tekrar aspirasyon toplamak ve iki kez (toplam üç yıkar) yıkama. Son yıkamadan sonra, boncuk pelet rahatsız etmeden, mümkün olduğunca tampon kadar aspire. Aspiratör doğru tüp Devrilme bu adımı ile yardımcı olur.
- Örnek elution: Her bir tüp 20-25μl 2x Laemmli örnek tamponu (azaltarak) ekleyin . Indirgen solüsyon içerisinde izole proteinleri serbest tutunmaya, NHS-SS-biotin disülfit bağı olacak. Çoğu zarı proteinleri haşlanmış kümeleme için son derece savunmasız ve SDS-PAGE jeller yüklemeden önce ısıtılmış olmamalıdır. Bu deneylerin gerçekleştirmeden önce ilgi protein ısı duyarlılığı belirleyin. Protein / kaynama ısıtma tahammül edemiyorsanız, SDS-PAGE ile analiz etmek için önce bir rotator, 30 ', oda sıcaklığında inkübe edin. Bu tutunmaya disülfit bağı için yeterli ve proteinler Zehir.
- SDS-PAGE ve immunoblotting: SDS-PAGE ile ayrı protein vardır. Her bir örnek için, aşağıdaki sırayla örnekleri çalıştırmak için en kolay: toplam yüzey protein uygun antikor (zaman = 0), şerit, içselleştirme durumu # 1, Durum # 2, vb immunoblotting için membran Transfer ve leke çıkar. Doymuş piksel olduğunu belli, bir CCD kamera jel dokümantasyon sistemi kullanarak immunoreaktif bantları yakalayın. Jel analizi / dansitometri yazılımı kullanarak her bir bant yoğunluğu niceliğini.
Temsilcisi Sonuçlar:
Bir temsilci immunoblotting sonucu Şekil 2A gösterilmiştir. Içselleştirilmesi için önce toplam miktarın yüzey proteini olan "toplam" şeritli (T), en güçlü sinyali. "Strip" kontrolü (S) ideal boş, şerit deneme için etkin olduğunu göstermektedir yakın olmalıdır. "Toplam" sokağın "strip" sokağın yoğunluğunu karşılaştırarak şerit verimliliği hesaplanır (örneğin şerit ile paralel biotinlenmiş olan protein, ama ne 37 ° C ısınmış ne sıyırma çözüm maruz kalmıştır). Bunun için aşağıdaki formül kullanılır:
[1 - (şerit / toplam)] * 100%
Bu formül kullanılarak, Şekil 2 şerit,% 99.8 verimli oldu. Son olarak, içselleştirme kulvarda toplam (lar) (I) daha az yoğunluk bantları göreceksiniz. Örnek (Şekil 2), araç veya 10 sırasında 1 mikrona kadar phorbol miristat asetat (PMA) ile muamele edilen hücreler ilk içselleştirilmesi süre tedavi edildi 'içselleştirme ve dopamin taşıyıcı içselleştirilmesi oranları 10 ölçüldü. Içselleştirme oranı olarak hesaplanır.aşağıdaki gibidir:
* 100 toplam / içselleştirilmiş
Şekil 2B görüldüğü gibi araç-tedavi edilen koşullar altında,% 10.4 yüzey DAT 10 'üzerinde içselleştirilmiş. PMA tedavi% 23.2, toplam yüzey DAT DAT içselleştirilmesi oranları arttı.
Şekil 1. Protokolü resimde. Hücreleri 4 biotinlenmiş ° C yüzey nüfusunun özel etiket ve 37 kaydırılır ° C içselleştirilmesi başlatmak için. Içselleştirilmesi ardından, hücreler hızla endositik süreçleri ve kalan yüzey biotin durdurmak için soğutulmuş bir indirgen olan hücreler tedavi ayrılır. T = 0 yüzey ortaya çıktı ve içselleştirilmiş, sıyırma tedavi böylece onları koruyan kalır sadece biotinlenmiş proteinler. Biotinlenmiş proteinler streptavidin boncuklar ile toplu afinite kromatografisi ile izole edilir ve ilgi protein immunoblotting tarafından algılanır.
Şekil 2. PKC aktivasyon DAT endositik oranı artar. İçselleştirme tahlil. Stably DAT ifade PC12 hücreleri biotinlenmiş, 4 ° C "Ayrıntılı Protokolü" nde açıklandığı gibi. Hücreler hızla 37 kaynaştı ° C ± 1 mcM PMA ve inkübe 10 ', 37 ° C Artık biotin azaltarak elimden, streptavidin afinite kromatografisi hücrelerinin parçalanmış ve biotinlenmiş proteinler izole edildi. (A) Temsilcisi immunoblotting toplam yüzey DAT gösteren t = 0 (T), şerit kontrolü (S) ve belirtilen koşullar altında içselleştirilmiş DAT (I). (B) Gruplar bir CCD kamera ile çekilen ve Miktar Veri yazılımı (Bio-Rad) ile ölçüldü. Veri% toplam DAT internalized/10 dakika olarak ifade edilir.
Şekil 3. Örnek immunoblotting, fakir bir biotin şerit. İçselleştirme tahlil tasvir . Stably DAT ifade PC12 hücreleri biotinlenmiş, 4 ° C "Ayrıntılı Protokolü" nde açıklandığı gibi. Hücreler hızla 37 kaynaştı ° C ve inkübe 10 '37 ° C. Artık biotin azaltarak elimden, streptavidin afinite kromatografisi hücrelerinin parçalanmış ve biotinlenmiş proteinler izole edildi. Immunoblotting toplam yüzey DAT t = 0 (T), şerit kontrol (S) ve içselleştirilmiş DAT (I). Kötü şerit verimlilik göstergesi görünür bant, şerit kontrol şeritte unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ortak sorunları: Bu deneylerde ortaya çıkan en sık karşılaşılan sorun, kötü şerit verimliliği . Şerit verimliliği sonuçları yorumlamak mümkün kritik. Şerit, son derece verimli olduğu sürece, içselleştirme şerit herhangi bir biotinlenmiş proteinler yüzeye içselleştirilmiş, aslında olduğu sonucuna varılması mümkün değildir. Şeritler ≥% 90 verimliliği en uygun olan ve şerit bu seviyenin altına düşerse herhangi bir sonuç atmak. Fakir bir şerit bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir. Şerit şerit bant oldukça görülebilir ve% 34 oranında bir şerit verimliliği karşılık gelen unutmayın. Kötü şerit verimliliği ortaya çıkarsa, taze TCEP hemen hücreler ekleyerek önce yapılmış sahip olmayabilir. Alternatif olarak, TCEP bozulmuş olabilir ve yeni reaktif satın gerekecektir. TCEP tozu kullanın, yerine, çözüm yerine bu sorunu aşmak olabilir.
Olası değişiklikler: cari rapor, içselleştirme ilk 10 dakika boyunca alınan göreceli bir DAT içselleştirme oranı ölçülür ve PKC etkinleştirme sırasında, DAT içselleştirme oranı karşılaştırdık. Alternatif olarak, mutlak bir oranda zaman noktalarında artan ısınma hücreleri tarafından ölçülen olabilir. Bu mümkün olsa da, deneyimlerimiz zaman noktaları çok erken zaman noktaları erken deneysel arası değişkenliği ile birleştiğinde düşük sinyal seviyeleri, yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar olmadığını göstermektedir. Ayrıca, biz yapışık hücrelere kullanılmasına karşın, tahlil hücre süspansiyonları için değiştirilmiş olabilir. Doku süspansiyonlar, bu sinaptozomlarda olarak da kullanılabilir. Ancak, bu membranların bütünlüğünü önce kurulmuş olması önemlidir. "Geçirgen" membranların hazırlanmasında önemli bir yüzdesini varsa, biyotinilasyon reaktif hücre içi protein etiket ve endositik oranda güvenilir bir şekilde belirlemek mümkün olmayacaktır. Bu durumda, immunoblots ayrıca hücre içi protein havuzunda biyotinilasyon reaktif maruz olup olmadığını test etmek için, böyle aktin hücre içi bir belirteç protein, probed olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma # DA15169 HEM hibe NIH tarafından finanse edildi
References
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent. Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).
