Summary
يمكن أن نقاط الاشتباك العصبي Glutamatergic التبديل من الوضع النشط لوضع صامت. علينا أن نظهر أن حالة النشاط قبل المشبكي في الثقافة فصلها من الخلايا العصبية القوارض وتصور باستخدام نموذج قابل للتثبيت الصبغة FM1 - 43 لتصور نقاط الاشتباك العصبي نشطة وimmunostaining مع vGluT 1 - الضد لتصور كل نقاط الاشتباك العصبي الغلوتامات.
Abstract
يكمن وراء اللدونة متشابك المرجح قدرة الجهاز العصبي على التعلم والتذكر ، وربما تمثل أيضا القدرة على التكيف التي يمنع ذلك من أن تصبح ضارة الشتائم أعصاب. لقد تم دراسة شكل من المرونة قبل المشبكي أن المثير للاهتمام ويرجع ذلك جزئيا يعبر عنه باعتباره التحول الرقمي على والخروج من قدرة المحطة قبل المشبكي ليالي لاطلاق سراح الحويصلات التي تحتوي على الغلوتامات العصبي. نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول لتصور حالة النشاط محطات قبل المشبكي في مزارع الخلايا تنفصل عن استعداد الحصين القوارض. وتعتمد الطريقة على الكشف عن نقاط الاشتباك العصبي النشطة باستخدام تلطيخ مع نموذج قابل للتثبيت الصبغة styryl FM1 - 43 ، تستخدم عادة لتسمية حويصلات متشابك. وبالمقارنة مع هذا الملف تلطيخ immunostaining من المحطات نفسه مع جسم مضاد موجه ضد الناقل الغلوتامات الحويصلي 1 (vGluT - 1) ، وصمة عار لتصميم ملصق عن نقاط الاشتباك العصبي الغلوتامات بغض النظر عن حالة التنشيط. نجد أن المحفزات لحث depolarizing إسكات قبل المشبكي. ويمكن تنشيط السكان من نقاط الاشتباك العصبي التي تلتزم الصمت في ظل ظروف خط الأساس إسكات الكهربائي لفترات طويلة أو عن طريق تنشيط مسارات cAMP في الإشارة.
Protocol
ثقافة إعداد
- إعداد الثقافات خلية من خلايا الفئران فصلها أو الماوس الحصين من يوم بعد الولادة 0-3 الحيوانات 1. الخلايا العصبية لدينا الالتزام المونولاير an نجمية الكامنة ، والتي بدورها تلتزم طبقة الكولاجين تنتشر على سمك ساترة عدد 0. لوحة الخلايا العصبية في مناطق ذات كثافة من حوالي 500 خلية لكل سنتيمتر مربع.
- السماح للثقافات أن ينمو لمدة 10-14 يوما للسماح للتنمية متشابك والنضج. علاج الثقافات في يوم 4 في المختبر مع أراك مضاد التفتل لاعتقال مزيد من النمو الدبقية. إطعامهم في يوم 5 في المختبر مع تبادل المتوسطة نصف مع Neurobasal المتوسطة بالاضافة الى ملحق B27 لتعزيز بقاء الخلايا العصبية.
- خلال الفترة من الثقافة ، وإدخال علاجات تهدف إلى تغيير عدد من نقاط الاشتباك العصبي إسكاته وظيفيا. نجد أن أحد طريقة ملائمة لإسكات نسبة كبيرة (~ 80 ٪) من نقاط الاشتباك العصبي الغلوتامات هو علاج 4 ساعات مع البوتاسيوم 30 ملم. يعد حضانات مع أضعف المحفزات لحث depolarizing مماثلة إسكات 2. ويمكن استخدام التحفيز 4 ساعات مع 50 ميكرومتر forskolin ، وهو منشط لcyclases أدينيليل ، لإيقاظ السكان من المحطات الصامتة في الأساس 3.
تصور المشابك صامتة
- وينبغي أن الخلايا لديها كثافة منخفضة نسبيا مع العمليات لالتهاب الأعصاب جيدا فصل في يوم 14/10 في المختبر وذلك لتسهيل التصور محطات متشابك منفصلة باستخدام المجهر مضان.
- إعداد محلول المخزون من 5 ملم FM1 - 43FX في الماء المقطر. ينبغي الحفاظ على المخزون في الظلام في 4 درجات مئوية. وينبغي أيضا جميع التجارب باستخدام FM1 - 43FX أن يؤديها في الظلام.
- التحدي الثقافات لمدة 2 دقيقة مع كلوريد البوتاسيوم 45 ملم في حل المالحة HEPES - مخزنة تحتوي على 100 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الكالسيوم 2 مم ، كلوريد المغنيسيوم 1 ملم ، 10 ملم الجلوكوز ، و 10 ميكرومتر FM1 - 43FX. هذا الحل يجب أن تحتوي أيضا على 1 و 25 ميكرومتر NBQX ميكرومتر D - APV لعرقلة ومنع المستقبلات بعد المشبكي الإشارات المتكررة. وهذا التحدي تسمية المحطات متشابك القادرة على إيماس والإلتقام. وقد صممت هذه المرة التحدي والقوة لسبب واحد على الأقل جولة إيماس جميع الحويصلات المتاحة في إعادة التدوير 4 حوض السباحة. ومع ذلك ، فإن التحدي لا يكفي لإسكات سبب إضافي من المحطات.
- غسل الثقافة لمدة 3 إلى 5 ثوان فقط ، وذلك باستخدام نفس HEPES - مخزنة المالحة دون كلوريد البوتاسيوم ، ولكن مع 500 ميكرومتر Advasep - 7 لإزالة الصبغة غير محدد 5. علما أن توقيت هذه الخطوة الحاسمة كتطبيق طويلة من Advasep - 7 سيؤدي إلى خسارة كل العلامات FM1 - 43FX. غسل المقبل في HEPES - مخزنة المالحة دون Advasep - 7 - 2 لفترات خمس دقائق.
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4 ٪ و 0.2 ٪ في غلوتارالدهيد PBS ، ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 10 دقيقة. غسل الخلايا لفترة وجيزة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ، ثم احتضان لمدة 15 دقيقة في محلول يحتوي على 4 ٪ حجب مصل الماعز العادية وتريتون 0.04 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني. علما بأن FM1 - 43FX أيضا حساسة جدا لكمية تريتون X - 100 ، وتستخدم هنا في خطوات لاحقة. عموما ، FM1 - 43FX الوسم هو الأفضل في ظل غياب أي 100 - X تريتون ، ولكن بعض المنظفات الضروري للخلايا permeabilize immunostaining اللاحقة. لقد عقدنا العزم تجريبيا أن 0.04 ٪ تريتون X - 100 هو الأمثل لدراسة نقاط الاشتباك العصبي presynaptically الصامتة.
- تمييع الأولية vGluT - 1 الأضداد في عرقلة الحل في تركيز 1:2500. احتضان الخلايا مع اهتزاز لطيف / التناوب في المخفف vGluT - 1 الضد لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. تأكد لتغطية الأطباق ثقافتك برقائق لمنع تبييض الصبغة FM1 - 43FX.
- غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني وثم احتضان خلايا جسم الخنزير مع مكافحة غينيا مترافق إلى fluorophore ذات الخصائص الطيفية المختلفة من FM1 - 43FX لتمييز البقع اثنين. لتجربتنا ، وسوف نستخدم اليكسا 555 مترافق الأضداد المضادة للخنزير غينيا في 1:500 في عرقلة الحل. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي في حين تهتز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل خلايا أربع مرات في برنامج تلفزيوني وجبل ثم زلة تغطية على شريحة زجاجية باستخدام قطرة صغيرة من Fluoromount - G. تأكد من ساترة لتوجيه الخلايا بحيث تواجه الشريحة. السماح للشرائح حتى يجف بين عشية وضحاها.
- نحن الآن على استعداد للحصول على الصور من نقاط الاشتباك العصبي نشطة وغير نشطة. يعد الهدف النفط مع 60 × 1.4 فتحة العددية على مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. وضع الشريحة على المسرح ، وضمان أن الجانب ساترة تواجه هذا الهدف. بعد التركيز على الشريحة ، وإيجاد مجال neurites غير كثيفة للغاية. ويوصى أيضا لتجنب التصوير بالقرب من سوما الخلية ، كما المتبقية FM1 - 43FX صبغة يمكن أن تبقى هناك حتى بعد غسله واسعة النطاق. لصورنا التجريبية ، ونحن عادة في التكبير لحجم الحقل من 51 51 ميكرون.
- اكتسابA Z - كومة من حقل معين تغطي عمق 7،8 ميكرون بخطوات 0.3 ميكرون 27. هذا النطاق هو ما يكفي لتغطية سمك neurites في ثقافتنا. لكل خطوة في Z - المكدس ، المسح الأولي مع ضوء الليزر الذي يثير المناعي للجسم vGluT 1 لتحديد جميع نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic في حقل المجهر. هو نفس الحقل إعادة فحصها في كل خطوة لFM1 - 43FX مضان. مجموعة محايدة الكثافة وتصفية مكاسب مضخم باستمرار بين جميع coverslips عن تجربة معينة ، وفي الوقت نفسه تجنب تشبع الإشارة. نكتسب عادة ≥ 5 حقول في حالة لكل تجربة.
- باستخدام برنامج التحليل ، تحويل Z - المكدس في صورة واحدة مركبة طائرة. العملية التي نستخدمها لهذا التحويل ينتج صورة على أساس الكثافة القصوى من أي طائرة في كل بكسل. هو thresholded صورة مركبة ويتم تحديد vGluT - 1 الطرفية للتحليل ، من دون الإشارة إلى FM1 - 43FX وصمة عار. وتتميز المناطق الملون ، ويشار إلى نقاط و، والمناطق ذات الاهتمام. نختار عادة 10 نقاط ولكل حقل. التالي thresholded القناة FM1 - 43FX وفرضه على المناطق المثيرة للاهتمام. ويستخدم البرنامج تحليل لقياس كثافة مضان كل إشارة فضلا عن مساحة كل punctum. يمكن استخدام المعيار المطلق بكسل أو بكسل معيار النسبة المئوية للتمييز نشطة من نقاط الاشتباك العصبي غير نشط.
ممثل النتائج
- في ثقافاتنا ، نجد أن 70-80 ٪ من نقاط الاشتباك العصبي الغلوتامات ، التي يحددها vGluT 1 - تلطيخ ، المعرض للكشف FM1 - 43 تلطيخ 2 ، 6-8. في صور متراكبة من الأخضر FM1 - 43 ومضان أحمر vGluT - 1 تلطيخ وينعكس ذلك على وفرة من نقاط والأصفر : المشابك مع المشارك المترجمة علامات. وأشارت هذه الأسهم من قبل.
- وحوالي 20-30 ٪ من (الحمراء) 1 - vGluT نقاط وفشل أن يكون إيجابيا (الخضراء) FM1 - 43 مضان فوق خط الأساس. هذه هي محطات نشطة قبل المشبكي ، وأشار على سبيل المثال من رأس السهم.
- كما ان ثلث سكان المشابك يمكن ملاحظتها. هذه هي ايجابية لل(الخضراء) FM1 - 43 مضان ولكن خالية من تلطيخ vGluT - 1 (الحمراء). هذه هي نقاط الاشتباك العصبي GABAergic نشطة ويشار على سبيل المثال من قبل النجمة. تستثنى من معظم هذه التحليلات لدينا ولكن يمكن دراستها بشكل صريح باستخدام نقل GABA الحويصلي الأضداد في مكان الضد vGluT - 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهمية
- عادة ما يعتقد أن نقاط الاشتباك العصبي للعمل عن طريق الإفراج عن الارسال مع وجود احتمال للقياس. العمل من أنفسنا والآخرين يجعل من الواضح أن بعض نقاط الاشتباك العصبي والحراريات إلى الإفراج عن الناقلات العصبية ، على الرغم من مجموعة كاملة من نقل الحويصلي العصبي وغيرها من علامات قبل المشبكي المفتاح 2 ، 6-8. لقد أظهرنا في وقت سابق ان نشاط الشبكة القاعدية في الخلايا العصبية أمر حاسم للحفاظ على هذه الفئة من السكان من نقاط الاشتباك العصبي غير نشط.
خطوات حاسمة
- إدراج غسل قصيرة مع 500 ميكرومتر Advasep - 7 يعزز إلى حد كبير على نوعية FM1 - 43FX تلطيخ. ومع ذلك ، حتى زيادة طفيفة في توقيت هذا يغسل أكثر من 5 ثوان نتيجة خسائر في FM1 - 43FX التوسيم.
- FM1 - 43FX حساس جدا لكمية X - 100 تريتون المستخدمة في جزء immunostaining البروتوكول. FM1 - 43FX الوسم هو الأفضل في ظل غياب أي 100 - X تريتون ، ولكن بعض المنظفات الضروري للخلايا permeabilize vGluT 1 - immunostaining. لقد عقدنا العزم تجريبيا أن 0.4 ٪ تريتون X - 100 هو الأمثل لدراسة نقاط الاشتباك العصبي presynaptically الصامتة.
التعديلات
- يمكن للمرء استخدام علامة بعد المشبكي باعتبارها الثالث 3 وصمة عار لضمان vGluT - 1 تلطيخ تمثل نقاط الاشتباك العصبي حسن النية : هي نقاط التماس بين الحويصلة لادن ومجموعات مستقبلات المحطات بعد المشبكي.
- يمكن للمرء أيضا أن تختار استخدام علامات أخرى قبل المشبكي الضد مثل علامة عموم متشابك ، SV2 ، أو vGAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق المنح والمعاهد الوطنية للصحة DA018109 MH78823 ، والمعاهد الوطنية للصحة الأعصاب الأساسية P30NS057105 مخطط المنح في جامعة واشنطن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming. J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).
- Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787-800 (2003).
- Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).
