Summary
Sinapsis glutamatérgica puede cambiar de un modo activo a un modo silencioso. Se demuestra que el estado de actividad presináptica en la cultura disociada de las neuronas de roedores se visualiza mediante un formulario puede arreglar de la FM1-43 tintes para visualizar las sinapsis activas y inmunotinción con vGluT-1 anticuerpo para visualizar todas las sinapsis de glutamato.
Abstract
Subyace en la plasticidad sináptica probable que la capacidad del sistema nervioso para aprender y recordar y también puede representar una adaptación de otro modo que impide que se convierta en perjudicial insultos neurotóxicos. Hemos estado estudiando una forma de plasticidad presináptica que es interesante, en parte, porque se expresa como una conmutación digital dentro y fuera de la capacidad de un terminal presináptica s para liberar vesículas que contienen el neurotransmisor glutamato. Aquí se demuestra un protocolo para la visualización del estado de la actividad de las terminales presinápticas en cultivos de células disociadas preparado desde el hipocampo de roedores. El método se basa en la detección de las sinapsis activa mediante la tinción con una forma corregible del colorante estirilo FM1-43, comúnmente utilizado para etiquetar las vesículas sinápticas. Este perfil de tinción se compara con la inmunotinción de los mismos terminales con un anticuerpo dirigido contra el transportador de glutamato vesicular 1 (vGluT-1), una mancha diseñado para etiquetar todas las sinapsis de glutamato, independientemente del estado de activación. Nos encontramos con que los estímulos despolarizantes inducir silenciamiento presináptica. La población de sinapsis que no se pronuncia en condiciones basales pueden ser activados por el silenciamiento eléctrico prolongado o por la activación de las vías de señalización del cAMP.
Protocol
Cultura preparación
- Preparar cultivos disociados celular de las células del hipocampo de rata o ratón desde el primer día postnatal 0-3 animales 1. Las neuronas se adhieran a una monocapa de astrocitos subyacentes, que a su vez se adhiere a una capa de colágeno extiende sobre un cubreobjetos número de espesor 0. Placa de las neuronas a una densidad de aproximadamente 500 células por centímetro cuadrado.
- Permita que las culturas de crecer durante 10-14 días para permitir el desarrollo y la maduración sináptica. El tratamiento de las culturas en el día 4 in vitro con la AraC antimitóticos para detener el crecimiento más gliales. Darles de comer en el día 5 in vitro con un intercambio de soportes de medio a medio con Neurobasal más suplemento B27 para mejorar la supervivencia neuronal.
- Durante el período de cultivo, introducción de los tratamientos diseñados para alterar el número de sinapsis funcionales silenciados. Nos encontramos con que una forma cómoda para silenciar a un gran porcentaje (80%) de las sinapsis de glutamato es un tratamiento de 4 horas con 30 mM de potasio. Ya incubaciones con débiles estímulos despolarizantes inducen 2 silenciar similar. La estimulación de 4 horas con 50 M forskolin, un activador de la adenilato ciclasa, se puede utilizar para despertar a la población de los terminales de silencio al inicio del estudio 3.
Visualización de sinapsis silenciosas
- Las células deben tener una densidad relativamente baja con los procesos de neuríticas bien separados en el día in vitro 10-14 con el fin de facilitar la visualización de los terminales sinápticos discretos mediante microscopía de fluorescencia.
- Prepare una solución madre de 5 mM FM1-43FX en agua destilada. Las acciones deben ser mantenidos en la oscuridad a 4 ° C. Todos los experimentos con FM1-43FX también se debe realizar en la oscuridad.
- Desafío de las culturas durante 2 minutos con 45 mM de cloruro de potasio en una solución salina tamponada con HEPES que contenía 100 mM de cloruro de sodio, cloruro de calcio 2 mM, 1 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de glucosa, y 10 M FM1-43FX. Esta solución también debe contener una M y 25 M NBQX D-APV para bloquear los receptores postsinápticos y prevenir la señalización recurrente. Este reto se marca terminales sinápticos que son capaces de exocitosis y endocitosis. El tiempo de desafío y resistencia están diseñados para causar al menos una ronda de la exocitosis de vesículas todos los disponibles en el grupo 4 de reciclaje. Sin embargo, el desafío no es suficiente para provocar el silenciamiento adicional de terminales.
- Lave la cultura de 3 a 5 segundos solamente, utilizando la misma solución salina tamponada HEPES sin cloruro de potasio, pero con 500 M Advasep-7 para quitar el tinte no específicos 5. Tenga en cuenta que la sincronización de este paso es fundamental, ya la aplicación prolongada de Advasep-7 se traducirá en la pérdida de todas las etiquetas FM1-43FX. Siguiente lavado en solución salina tamponada HEPES sin Advasep-7 durante cinco intervalos de 2 minutos.
- Fijar las células con paraformaldehído al 4% y el 0,2% de glutaraldehído en PBS, pH 7,4 durante 10 minutos. Lave las células una vez brevemente con PBS, y luego se incuban durante 15 minutos en solución de bloqueo que contienen 4% de suero normal de cabra y el 0,04% de Triton X-100 en PBS. Tenga en cuenta que FM1-43FX es también muy sensible a la cantidad de Triton X-100 se utiliza aquí y en los pasos posteriores. En términos generales, FM1-43FX etiquetado es el mejor en la ausencia de Triton X-100, pero un poco de detergente es necesaria para permeabilizar las células de tinción posterior. Se ha determinado empíricamente que el 0,04% Triton X-100 es óptimo para el examen de las sinapsis presináptico en silencio.
- Diluir el principal vGluT-1 anticuerpo en solución de bloqueo a una concentración de 1:2500. Se incuban las células con agitación suave y / o rotación en los gases de vGluT-1 anticuerpo durante 3 horas a temperatura ambiente. Asegúrese de cubrir sus placas de cultivo con papel aluminio para evitar la decoloración del colorante FM1-43FX.
- Lavar las células dos veces en PBS y se incuban las células con un anticuerpo anti-indias de cerdo conjugado con un fluoróforo con diferentes características espectrales de FM1-43FX para distinguir las dos manchas. Para nuestro experimento, vamos a utilizar Alexa 555-conjugado de anticuerpos anti-indias de cerdo a 1:500 en solución de bloqueo. Se incuban las células con el anticuerpo secundario mientras se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar las células cuatro veces más en PBS y luego montar el cubreobjetos sobre un portaobjetos con una pequeña gota de Fluoromount-G. Asegúrese de orientar el cubreobjetos para que las células frente a la diapositiva. Deje que el que se sequen durante la noche.
- Ahora estamos listos para tomar imágenes de las sinapsis activas e inactivas. Prepare un objetivo de aceite 60 x con una abertura de 1,4 numérica en un microscopio láser confocal de barrido. Coloque una diapositiva en el escenario, asegurando que el lado del cubreobjetos se enfrenta el objetivo. Después de enfocar la diapositiva, encontrará un campo de neuritas que no es demasiado denso. También se recomienda para evitar la imagen de cerca del soma celular, como residual FM1-43FX medio de contraste puede permanecer allí aún después de un prolongado lavado. Para nuestras imágenes experimentales, por lo general acercar a un tamaño de campo de 51 51 micras.
- Adquirirun z-stack en un determinado campo que abarca una profundidad de 7,8 micrones, con 27 0,3 micrones pasos. Este rango es suficiente para cubrir el espesor de las neuritas en nuestra cultura. Para cada paso en el z-stack, primera exploración con la luz láser que excita inmunofluorescencia de la vGluT-1 anticuerpo para identificar todas las sinapsis glutamatérgicas en un microscopio de campo. El mismo campo se vuelve a escanear a cada paso para FM1-43FX fluorescencia. Establecer filtros de densidad neutra y ganancias fotomultiplicador consistente entre todos los cubreobjetos para un experimento dado, evitando la saturación de la señal. Por lo general adquieren ≥ 5 campos de cada condición en cada experimento.
- Utilizando el software de análisis, convertir la z-stack en un compuesto de un solo plano de la imagen. El proceso que utilizamos para esta conversión produce una imagen basada en la intensidad máxima de cualquier avión en cada píxel. La imagen compuesta es un umbral y un vGluT terminales se identifican para su análisis, sin hacer referencia a la FM1-43FX mancha. Las zonas manchadas, conocido como puntos lagrimales, se marcan como zonas de interés. Por lo general selecciona 10 puntos lagrimales por campo. A continuación, el canal de FM1-43FX es un umbral y las regiones de interés se superponen. El software de análisis se utiliza para cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada señal, así como el área de cada punto lagrimal. Un criterio absoluto de píxeles o un criterio del porcentaje de píxeles se puede utilizar para distinguir activa de las sinapsis inactivas.
Resultados representante
- En nuestra cultura, nos encontramos con que el 70-80% de las sinapsis de glutamato, que se define por vGluT-1 manchas, exposición detectable FM1-43 tinción 2, 6-8. En las imágenes superpuestas de color verde fluorescente FM1-43 y el rojo vGluT-1 tinción esto se refleja en una abundancia de color amarillo puntos lagrimales: las sinapsis con las co-localizados marcadores. Estas son las que indican las flechas.
- Aproximadamente el 20-30% de los (rojo) vGluT-1 puntos lagrimales positivo dejar de tener (verde) FM1-43 fluorescencia por encima de línea de base. Estas son las terminales presinápticas inactiva, y un ejemplo es indicado por la flecha.
- Una tercera población de sinapsis también se observó. Estos son positivos para (verde) FM1-43, pero carece de fluorescencia (rojo) vGluT-1 tinción. Estas sinapsis GABAérgicas están activos y un ejemplo es indicado por el asterisco. Estos son excluidos de la mayoría de nuestros análisis, pero puede ser explícitamente estudiada usando un transportador vesicular de anticuerpos GABA en el lugar de la vGluT-1 anticuerpo.
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Discussion
Significado
- Normalmente, las sinapsis se cree que funcionan por la liberación del transmisor con una probabilidad cuantificable. Trabajo por nosotros y los demás se hace evidente que algunas sinapsis son refractarios a la liberación de neurotransmisores, a pesar de una gama completa de transporte vesicular de neurotransmisores y otros indicadores clave presináptica 2, 6-8. Hemos demostrado anteriormente que la actividad de la red básica en las neuronas es fundamental para mantener esta población de sinapsis inactivas.
Los pasos críticos
- La inclusión de un breve lavado con 500 mM Advasep-7 mejora significativamente la calidad de FM1-43FX manchas. Sin embargo, incluso un ligero aumento en el tiempo de este lavado de más de 5 segundos se traducirá en la pérdida de FM1-43FX etiquetado.
- FM1-43FX es muy sensible a la cantidad de Triton X-100 utilizan en la parte de la inmunotinción del protocolo. FM1-43FX etiquetado es el mejor en la ausencia de Triton X-100, pero un poco de detergente es necesaria para permeabilizar las células de vGluT-1 inmunoticción. Se ha determinado empíricamente que un 0,4% Triton X-100 es óptimo para el examen de las sinapsis presináptico en silencio.
Modificaciones
- Se puede utilizar un marcador postsináptico como 3 ª mancha para asegurar vGluT-1 tinción representa bona fide sinapsis: puntos de contacto entre vesículas cargadas de racimos terminales y postsináptica de los receptores.
- También se puede optar por utilizar otros marcadores de anticuerpos presináptica como el marcador pan-sináptica, SV2, o vGAT.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH DA018109 y MH78823, y el NIH Blueprint de Neurociencias básicas P30NS057105 subvención a la Universidad de Washington.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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