Summary
Glutamaat synapsen kunnen overschakelen van een actieve modus naar een stille modus. We laten zien dat presynaptische activiteit status in gedissocieerde cultuur van knaagdieren neuronen wordt gevisualiseerd met behulp van een Muur vorm van de FM1-43 dye om actieve synapsen visualiseren en immunokleuring met vGluT-1 antilichaam op alle glutamaat synapsen te visualiseren.
Abstract
Synaptische plasticiteit waarschijnlijk ten grondslag ligt aan het zenuwstelsel in staat is om te leren en te onthouden en kan vertegenwoordigen ook een aanpassingsvermogen dat anders voorkomt dat schadelijke beledigingen worden van neurotoxische. We zijn het bestuderen van een vorm van presynaptische plasticiteit die interessant is voor een deel omdat het wordt uitgedrukt als een digitale in-en uitschakelen van het vermogen van een presynaptische terminal s naar blaasjes die de neurotransmitter glutamaat release. Hier laten we zien een protocol voor het visualiseren van de activiteit status van de presynaptische terminals in gedissocieerde celkweken bereid uit de knaagdieren hippocampus. De methode is gebaseerd op het detecteren van actieve synapsen met behulp van kleuring met een Muur vorm van de styrylkleurstoffen kleurstof FM1-43, vaak gebruikt voor de synaptische blaasjes label. Deze vlekken profiel wordt vergeleken met immunokleuring van dezelfde terminals met een antilichaam gericht tegen de vesiculaire glutamaat transporter 1 (vGluT-1), een vlek ontworpen om het etiket alle glutamaat synapsen, ongeacht de activatie status. We vinden dat depolariserende stimuli presynaptische zwijgen op te wekken. De bevolking van synapsen die stil is onder baseline omstandigheden kan geactiveerd worden door langdurige elektrische zwijgen op te leggen of door activatie van cAMP signaalwegen.
Protocol
De bereiding
- Bereid los celculturen van rat of muis hippocampus cellen van postnatale dag 0 tot 3 dieren 1. Onze neuronen zich te houden aan een onderliggende astrocyten monolaag, die hecht op zijn beurt een collageen laag verspreid over een aantal 0 dikte van dekglaasje aan. Het bord van de neuronen bij een dichtheid van ongeveer 500 cellen per vierkante centimeter.
- Laat de culturen om te groeien voor de 10-14 dagen voor synaptische ontwikkeling en rijping mogelijk te maken. Behandel de culturen op dag 4 in vitro met de antimitotische AraC om verdere groei gliale arresteren. Voed ze op dag in vitro 5 met een half medium uit te wisselen met Neurobasal medium plus B27 aanvulling op de neuronale overleving te verbeteren.
- Gedurende de periode van cultuur, voeren behandelingen ontwikkeld om het aantal functioneel zwijgen synapsen veranderen. We vinden dat een handige manier om een groot percentage (~ 80%) van glutamaat synapsen stilte is een 4-uur behandeling met 30 mM kalium. Langere incubaties met zwakkere depolariserende stimuli leiden tot soortgelijke zwijgen op te leggen 2. 4-uur stimulatie met 50 uM Forskolin, een activator van adenylyl cyclases, kan gebruikt worden om de populatie van de stille terminals wakker worden bij baseline 3.
Visualiseren stille synapsen
- De cellen moeten hebben een relatief lage dichtheid met goed gescheiden neuritische processen dagen in vitro 10-14 om visualisatie van discrete synaptische terminals met behulp van fluorescentie microscopie mogelijk te maken.
- Bereid een voorraad oplossing van 5 mM FM1-43FX in gedistilleerd water. De voorraad moet worden gehandhaafd in het donker bij 4 ° C. Alle experimenten met behulp van FM1-43FX moet ook worden uitgevoerd in het donker.
- Daag de culturen voor 2 minuten met 45 mM kaliumchloride in een HEPES-gebufferde zoutoplossing met 100 mM natriumchloride, 2 mM calciumchloride, 1 mM magnesiumchloride, 10 mM glucose, en 10 uM FM1-43FX. Deze oplossing moet bevatten ook 1 uM en 25 uM NBQX D-APV aan de postsynaptische receptoren blokkeren en terugkerende signalering te voorkomen. Deze uitdaging zal label synaptische terminals die in staat zijn exocytose en endocytose. De uitdaging tijd en kracht zijn ontworpen om ten minste een ronde van exocytose van alle beschikbare blaasjes in de recycling zwembad 4 veroorzaken. Echter, de uitdaging is niet voldoende om extra zwijgen van terminals veroorzaken.
- Was de cultuur van 3 tot 5 seconden, met behulp van dezelfde HEPES-gebufferde zoutoplossing zonder kaliumchloride, maar met 500 uM Advasep-7 tot en met niet-specifieke kleurstof te verwijderen 5. Merk op dat de timing van deze stap is essentieel als langdurige toepassing van Advasep-7 zal resulteren in het verlies van alle FM1-43FX labeling. Volgende wasbeurt in HEPES-gebufferde zoutoplossing zonder Advasep-7 voor vijf twee-minuten intervallen.
- Fix cellen met 4% paraformaldehyde en 0,2% glutaaraldehyde in PBS, pH 7,4 gedurende 10 minuten. Was de cellen een keer kort met PBS, dan incubeer gedurende 15 minuten in het blokkeren van oplossing die 4% normaal geit serum en 0,04% Triton X-100 in PBS. Merk op dat FM1-43FX is ook zeer gevoelig voor de hoeveelheid van de Triton X-100 hier en in latere stappen gebruikt. In het algemeen, FM1-43FX etikettering is het beste in het ontbreken van een Triton X-100, maar sommige reinigingsmiddel is nodig om cellen voor de volgende immunokleuring permeabilize. We hebben empirisch vastgesteld dat 0,04% Triton X-100 is optimaal voor het onderzoek van presynaptically stille synapsen.
- Verdun de primaire vGluT-1 antilichaam in het blokkeren van oplossing bij een concentratie van 1:2500. Incubeer de cellen met zacht schudden / rotatie in de verdunde vGluT-1 antilichaam gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat uw cultuur gerechten te dekken met folie om te voorkomen dat bleken van de FM1-43FX kleurstof.
- Was de cellen twee keer in PBS en vervolgens Incubeer de cellen met een anti-cavia antilichaam geconjugeerd aan een fluorofoor met verschillende spectrale eigenschappen van FM1-43FX om de twee vlekken te onderscheiden. Voor ons experiment, zullen we gebruik maken Alexa 555-geconjugeerd anti-cavia antilichaam op 1:500 in het blokkeren van oplossing. Incubeer de cellen met het secundaire antilichaam, terwijl schudden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen nog vier keer in PBS en monteer vervolgens het dekglas op een glasplaatje met behulp van een kleine druppel Fluoromount-G. Zorg ervoor dat u te oriënteren het dekglaasje zodat de cellen het gezicht van de dia. Laat de dia's te drogen 's nachts.
- We zijn nu klaar om beelden van de actieve en inactieve synapsen te verwerven. Bereid een 60 x olie objectief met een 1,4 numerieke apertuur op een confocale laser scanning microscoop. Plaats een dia op het podium, zodat de dekglaasje kant is het doel gericht. Na het richten van de glijbaan, een veld van neurieten dat niet al te dicht. Het wordt ook aanbevolen om beeldvorming in de buurt van de cel soma te vermijden, als restafval FM1-43FX kleurstof kan er blijven, zelfs na uitgebreid wassen. Voor onze experimentele beelden, hebben we meestal inzoomen op een veldgrootte van 51 51 micron.
- Verwerveneen z-stack van een bepaald gebied met betrekking tot een diepte van 7,8 micron met 27 0,3-micron stappen. Dit gamma is genoeg om de dikte van de neurieten in onze cultuur te dekken. Voor elke stap in de z-stack, eerst scannen met de laser licht dat prikkelt immunofluorescentie van de vGluT-1 antilichaam op alle glutamaat synapsen in een microscoop veld te identificeren. Hetzelfde veld is opnieuw gescand bij elke stap voor de FM1-43FX fluorescentie. Stel neutrale dichtheid filtering en fotomultiplier winsten consequent bij alle dekglaasjes voor een bepaalde experiment, terwijl het vermijden van verzadiging van het signaal. We meestal te verwerven ≥ 5 velden per voorwaarde voor elk experiment.
- Met behulp van analyse software, zetten de z-stack in een samengesteld single-plane beeld. Het proces dat we gebruiken voor deze omzetting levert een beeld op basis van de maximale intensiteit van een vliegtuig op elke pixel. Het samengestelde beeld is thresholded en vGluT-1-terminals worden geïdentificeerd voor analyse, zonder verwijzing naar de FM1-43FX vlek. Bevlekte gebieden, aangeduid als puncta, zijn gemarkeerd als regio van belang zijn. We meestal kiezen 10 puncta per veld. Vervolgens wordt de FM1-43FX kanaal is thresholded en de regio van belang zijn gesuperponeerd. De analyse software wordt gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van elk signaal, alsmede op het gebied van elk punctum kwantificeren. Een absolute pixel criterium of een percentage pixel criterium kan worden gebruikt om een actieve onderscheiden van niet-actieve synapsen.
Representatieve resultaten
- In onze culturen, vinden we dat 70-80% van glutamaat synapsen, bepaald door vGluT-1 kleuring, detecteerbaar FM1-43 kleuring 2, 6-8 vertonen. In overlay beelden van groene FM1-43 fluorescentie en rode vGluT-1 kleuring dat komt tot uiting als een overvloed aan geel puncta: synapsen met co-gelokaliseerde markers. Deze worden aangegeven door de pijltjes.
- Ongeveer 20-30% van de (rood) vGluT-1 positieve puncta zal niet (groen) FM1-43 fluorescentie boven de basislijn hebben. Dit zijn de inactieve presynaptische terminals, en een voorbeeld wordt aangegeven door de pijlpunt.
- Een derde populatie van synapsen zal ook worden waargenomen. Deze zijn positief voor (groen) FM1-43 fluorescentie, maar verstoken van (rood) vGluT-1 kleuring. Dit zijn actieve GABA-erge synapsen en een voorbeeld wordt aangegeven met het sterretje. Deze worden uitgesloten van de meeste van onze analyses, maar kan expliciet worden bestudeerd met behulp van een vesiculaire GABA transporter antilichaam in plaats van de vGluT-1 antilichaam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betekenis
- Typisch synapsen worden verondersteld om te werken door het vrijgeven van de zender met een meetbare waarschijnlijkheid. Werk van onszelf en anderen maakt het duidelijk dat sommige synapsen ongevoelig zijn voor het vrijgeven van neurotransmitter, ondanks een volledige aanvulling van vesiculaire neurotransmitter transporter en andere belangrijke presynaptische markers 2, 6-8. We hebben eerder aangetoond dat de basale netwerk activiteit in neuronen is essentieel om deze populatie van niet-actieve synapsen te behouden.
Kritische stappen
- Opname van een korte wassen met 500 uM Advasep-7 verbetert aanzienlijk de kwaliteit van de FM1-43FX vlekken. Toch zal zelfs een lichte toename van de timing van deze spoelen meer dan 5 seconden leiden tot het verlies van de FM1-43FX labeling.
- FM1-43FX is zeer gevoelig voor de hoogte van Triton X-100 gebruikt in de immunokleuring deel van het protocol. FM1-43FX etikettering is het beste in het ontbreken van een Triton X-100, maar sommige reinigingsmiddel is nodig om cellen voor vGluT-1 immunokleuring permeabilize. We hebben empirisch vastgesteld dat 0,4% Triton X-100 is optimaal voor het onderzoek van presynaptically stille synapsen.
Wijzigingen
- Men kan gebruik maken van een postsynaptische marker als een 3 e vlek om ervoor te zorgen vGluT-1 kleuren vertegenwoordigt bonafide synapsen: punten van contact tussen de vesikel-beladen-terminals en postsynaptische receptor clusters.
- Men kan er ook voor kiezen om andere presynaptische antilichaam markers, zoals de pan-synaptische marker, SV2 of vGAT gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH beurzen DA018109 en MH78823, en NIH Neuroscience Blueprint Core Grant P30NS057105 naar Washington University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming. J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).
- Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787-800 (2003).
- Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).
