Summary
Synapses glutamatergiques peut basculer d'un mode actif à un mode silencieux. Nous démontrons que le statut de l'activité présynaptique dans la culture de neurones dissociés de rongeurs est visualisée en utilisant un formulaire fixable du FM1-43 de colorant pour visualiser synapses actives et immunomarquage avec des anticorps vGluT-1 pour visualiser toutes les synapses glutamate.
Abstract
Sous-tend la plasticité synaptique vraisemblablement la capacité du système nerveux, d'apprendre et de se souvenir et peut également représenter une adaptabilité qui empêche par ailleurs d'endommager les insultes de devenir neurotoxiques. Nous avons étudié une forme de plasticité présynaptique qui est intéressant, en partie parce qu'elle est exprimée comme une commutation numérique sur et en dehors de la capacité d'un terminal présynaptique s pour libérer des vésicules contenant le neurotransmetteur glutamate. Ici nous démontrons un protocole pour la visualisation de l'état d'activité des terminaisons présynaptiques dans les cultures cellulaires dissociées préparées à partir de l'hippocampe chez les rongeurs. La méthode repose sur la détection des synapses actives utilisant une coloration avec une forme fixable du colorant styryle FM1-43, communément utilisé pour étiqueter les vésicules synaptiques. Ce profil est comparé à coloration immunologique des bornes même avec un anticorps dirigé contre le transporteur du glutamate vésiculaire 1 (vGluT-1), une tache conçue pour étiqueter toutes les synapses glutamate indépendamment de leur statut d'activation. Nous constatons que les stimuli dépolarisants induisent taire présynaptique. La population de synapses qui est silencieux dans des conditions de base peuvent être activés en faisant taire électriques prolongées ou par l'activation des voies de signalisation de l'AMPc.
Protocol
Préparation de la Culture
- Préparer des cultures de cellules dissociées de cellules de rat ou la souris hippocampe du jour postnatal 0-3 animaux 1. Nos neurones adhèrent à une monocouche sous-jacentes des astrocytes, qui adhère à son tour à une couche de collagène étalé sur une lamelle d'épaisseur numéro 0. Assiette des neurones à une densité d'environ 500 cellules par centimètre carré.
- Autoriser les cultures de croître pendant 10-14 jours pour permettre le développement et la maturation synaptique. Traiter les cultures à jour in vitro, 4 avec l'AraC antimitotiques pour arrêter la croissance d'autres cellules gliales. Nourrissez-les à jour in vitro, 5 avec une moyenne d'échange moitié avec milieu Neurobasal ainsi B27 supplément pour améliorer la survie neuronale.
- Pendant la période de culture, d'introduire des traitements conçus pour modifier le nombre de synapses fonctionnelles réduites au silence. Nous constatons qu'un moyen pratique de réduire au silence un grand pourcentage (~ 80%) des synapses glutamate est un traitement de 4 heures avec 30 mM de potassium. Plus faibles incubations avec des stimuli dépolarisants induisent 2 taire similaires. La stimulation de 4 heures avec 50 uM, un activateur de la forskoline cyclases cyclase, peut être utilisé pour éveiller la population de terminaux silencieuse au départ 3.
Visualisation des synapses silencieuses
- Les cellules doivent avoir une densité relativement faible avec les processus neuritique bien séparés à jour in vitro de 10 à 14 afin de faciliter la visualisation des terminaisons synaptiques discrets en utilisant la microscopie à fluorescence.
- Préparer une solution mère de 5 mM FM1-43FX dans l'eau distillée. Le stock doit être maintenu dans l'obscurité à 4 ° C. Toutes les expériences utilisant FM1-43FX doit également être effectué dans l'obscurité.
- Défi des cultures pendant 2 minutes avec 45 mM de chlorure de potassium dans une solution saline tamponnée HEPES contenant 100 mM de chlorure de sodium, chlorure de calcium 2 mM, 1 mM de chlorure de magnésium, 10 mM de glucose et 10 uM FM1-43FX. Cette solution devrait également contenir une pM et 25 pM NBQX D-APV pour bloquer les récepteurs post-synaptiques et d'empêcher la signalisation récurrentes. Ce défi sera d'étiquettes terminaisons synaptiques qui sont capables de l'exocytose et l'endocytose. Le temps de défi et de résistance sont conçus pour provoquer au moins un tour de l'exocytose des vésicules de tous disponibles dans le pool de quatre recyclage. Cependant, le défi n'est pas suffisante pour causer taire supplémentaire de terminaux.
- Laver la culture pendant 3 à 5 secondes seulement, en utilisant le même HEPES solution saline tamponnée sans chlorure de potassium, mais avec 500 uM Advasep-7 à éliminer le colorant non spécifique 5. Notez que le calendrier de cette étape est essentielle comme l'application prolongée de Advasep-7 se traduira par la perte de tout étiquetage FM1-43FX. Prochain lavage dans une solution saline tamponnée HEPES sans Advasep-7 pendant cinq intervalles de 2 minutes.
- Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% et 0,2% de glutaraldéhyde dans du PBS, pH 7,4 pendant 10 minutes. Laver les cellules une fois brièvement avec du PBS, puis incuber pendant 15 minutes dans une solution de blocage contenant 4% de sérum de chèvre normal et 0,04% de Triton X-100 dans le PBS. Notez que FM1-43FX est également très sensible à la quantité de Triton X-100 utilisé ici et dans les étapes ultérieures. De manière générale, FM1-43FX étiquetage est le mieux en l'absence de toute Triton X-100, mais un peu de détergent est nécessaire de perméabiliser les cellules pour l'immunocoloration ultérieures. Nous avons déterminé empiriquement que 0,04% de Triton X-100 est optimale pour l'examen des synapses présynaptique silencieux.
- Diluer le principal vGluT-1 anticorps dans la solution de blocage à une concentration de 1:2500. Incuber les cellules avec agitation douce / rotation dans le diluée vGluT-1 anticorps pour 3 heures à température ambiante. Soyez sûr de couvrir vos boîtes de culture avec du papier pour empêcher le blanchiment de la teinture FM1-43FX.
- Laver les cellules deux fois en PBS puis incuber les cellules avec un anticorps anti-cochon Guinée conjugué à un fluorophore avec des caractéristiques spectrales différentes à partir FM1-43FX de distinguer les deux taches. Pour notre expérimentation, nous allons utiliser Alexa 555-anticorps conjugué de porc anti-Guinée à 1:500 dans une solution de blocage. Incuber les cellules avec l'anticorps secondaire tout en agitant pendant 30 minutes à température ambiante.
- Laver les cellules quatre fois plus dans le PBS et ensuite monter la lamelle sur une lame de verre en utilisant une petite goutte de Fluoromount-G. Veillez à orienter la lamelle afin que les cellules face à la diapositive. Laisser les lames sécher pendant la nuit.
- Nous sommes maintenant prêts pour acquérir des images des synapses actives et inactives. Préparer un objectif d'huile de 60 x 1,4 avec une ouverture numérique sur un microscope confocal à balayage laser. Placer une lame sur la platine, en s'assurant que le côté face de la lamelle est objectif. Après s'être concentrée la diapositive, trouver un domaine de neurites qui n'est pas trop dense. Il est également recommandé d'éviter d'imagerie à proximité du corps cellulaire, comme résiduel FM1-43FX colorant peut y rester même après lavage approfondi. Pour nos images expérimentales, nous avons généralement un zoom sur un champ de 51 51 microns.
- D'acquérirun z-stack d'un domaine donné couvrant une profondeur de 7,8 microns avec 27 0,3 microns étapes. Cette gamme est suffisant pour couvrir l'épaisseur des neurites dans notre culture. Pour chaque étape de la Z-stack, premier scan avec la lumière laser qui excite immunofluorescence de la vGluT-1 anticorps pour identifier toutes les synapses glutamatergiques dans un champ de microscope. Le même champ est re-scanné à chaque étape pour FM1-43FX fluorescence. Set de filtrage de densité neutre et les gains photomultiplicateur constamment entre tous lamelles pour une expérience donnée, tout en évitant la saturation du signal. Nous généralement acquérir ≥ 5 champs par condition pour chaque expérience.
- Utiliser des logiciels d'analyse, de convertir le z-stack dans un composite unique plan de l'image. Le processus que nous utilisons pour cette conversion produit une image basée sur l'intensité maximale de tout avion à chaque pixel. L'image composite est seuillée et vGluT-1 terminaux sont identifiés pour l'analyse, sans référence à l'FM1-43FX tache. Les endroits souillés, dénommé lacrymaux, sont marqués comme des régions d'intérêt. Nous généralement sélectionner 10 points lacrymaux par champ. Suivant le canal FM1-43FX est seuillé et les régions d'intérêt sont superposées. Le logiciel d'analyse est utilisée pour quantifier l'intensité de fluorescence de chaque signal ainsi que la superficie de chaque punctum. Un critère de pixel absolues ou un critère pixel pourcentage peut être utilisé pour distinguer des synapses actives inactives.
Les résultats représentatifs
- Dans nos cultures, nous constatons que 70-80% des synapses du glutamate, défini par vGluT-1 coloration, présentent détectable FM1-43 coloration 2, 6-8. En images superposées de vert FM1-43 de fluorescence rouge et vGluT-1 coloration cela se reflète aussi une abondance de jaune lacrymaux: synapses avec les co-localisés marqueurs. Ils sont indiqués par des flèches.
- Environ 20-30% des (en rouge) vGluT-1 lacrymaux positive manquer d'avoir (en vert) FM1-43 fluorescence au-dessus de base. Ce sont les terminaux inactifs présynaptique, et un exemple est indiqué par la flèche.
- Une troisième population des synapses seront également observés. Ce sont positifs pour (vert) FM1-43 de fluorescence, mais dépourvue de (rouge) vGluT-1 coloration. Ce sont des actifs synapses GABAergiques et un exemple est indiqué par l'astérisque. Ce sont exclus de la plupart de nos analyses, mais peut être explicitement étudiées en utilisant un anticorps transporteur vésiculaire du GABA à la place du vGluT-1 anticorps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Signification
- Typiquement synapses sont pensés pour fonctionner en libérant l'émetteur avec une probabilité mesurable. Le travail par nous-mêmes et d'autres, il est évident que certaines synapses sont réfractaires à la libération de neurotransmetteurs, en dépit d'une gamme complète de transporteur vésiculaire des neurotransmetteurs et des autres principaux marqueurs présynaptique 2, 6-8. Nous avons montré précédemment que l'activité du réseau basale dans les neurones est essentiel de maintenir cette population de synapses inactives.
Les étapes critiques
- L'inclusion d'un bref lavage avec 500 uM Advasep-7 améliore significativement la qualité de FM1-43FX coloration. Cependant, même une légère augmentation dans le calendrier de ce lavage plus de 5 secondes se traduira par la perte de FM1-43FX étiquetage.
- FM1-43FX est très sensible à la quantité de Triton X-100 utilisé dans la partie immunomarquage du protocole. FM1-43FX étiquetage est le mieux en l'absence de toute Triton X-100, mais un peu de détergent est nécessaire de perméabiliser les cellules pour vGluT-1 immunomarquage. Nous avons déterminé empiriquement que 0,4% Triton X-100 est optimale pour l'examen des synapses présynaptique silencieux.
Modifications
- On peut utiliser un marqueur postsynaptique comme une tache de 3 e pour assurer vGluT-1 représente coloration bona fide des synapses: points de contact entre vésicules chargées terminaux et amas de récepteurs post-synaptiques.
- On peut aussi choisir d'utiliser d'autres marqueurs d'anticorps présynaptique tels que le marqueur pan-synaptique, SV2, ou vGAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH et de DA018109 MH78823, et les NIH Neuroscience Blueprint base Grant P30NS057105 à l'Université de Washington.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming. J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).
- Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787-800 (2003).
- Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).
