Summary
グルタミン酸作動性シナプスはサイレントモードにアクティブモードを切り替えることができます。我々は齧歯類の神経細胞の分散培養でそのシナプス前の活動状況を示すと、アクティブなシナプスを可視化するためにFM1 - 43色素の修正可能なフォームを使用し、すべてのグルタミン酸シナプスを可視化するvGluT - 1抗体による免疫染色可視化される。
Abstract
シナプス可塑性の基礎となる学び、覚え、また神経毒性になることから特に有害な侮辱を防止する適応性を表す可能性があるために神経系の能力。それは神経伝達物質のグルタミン酸を含む小胞を放出するシナプス前終末の能力のデジタルスイッチングのオンとオフのように表されるので、我々は一部に興味深いものですシナプス可塑性の形態を研究している。ここでは、齧歯類の海馬から調製した解離細胞培養におけるシナプス前終末の活動状況を可視化するためのプロトコルを示す。方法は、一般的にシナプス小胞を標識するために使用されるスチリル色素FM1 - 43の修正可能な形で染色を使用してアクティブなシナプスの検出に依存しています。この染色プロファイルは小胞性グルタミン酸輸送体1（vGluT - 1）に関係なく、活性化状態のすべてのグルタミン酸シナプスを標識するために設計された汚れに対する抗体と同じ端子の免疫染色と比較されます。私たちは、脱分極刺激はシナプス前サイレンシングを誘導することがわかります。ベースライン条件の下で静かであるシナプスの人口は、長期にわたる電気サイレンシングによってまたはcAMPシグナル伝達経路の活性化によって活性化することができます。
Protocol
文化の準備
- 0から3の動物1生後からラットまたはマウスの海馬細胞の解離細胞の培養します。私たちの神経細胞はに番号0の厚さのカバーガラスに広がるコラーゲン層への付着を回す基本的なアストロサイト単分子層、に従っている。平方センチメートル当たり約500個の細胞の密度で神経細胞プレート。
- 文化がシナプス発達と成熟を可能にするために10-14日のために成長することができます。さらにグリア成長を阻止するために抗有糸分裂AraCので試験管4日で文化を扱う。ニューロンの生存を高めるためにNeurobasal培地+ B27サプリメント半培地交換をin vitroで5日間でそれらを養う。
- 培養期間中に、機能的に沈黙シナプスの数を変更するように設計された治療法を紹介。我々は、グルタミン酸シナプスの割合が大きい（〜80％）を黙らせるつの便利な方法は、30mMのカリウムと4時間の治療であることがわかります。弱い脱分極刺激によるインキュベーション時間が長いほど同じようなサイレン2を誘導する。 50μMフォルスコリン、アデニリルシクラーゼの活性化、4時間の刺激は、ベースライン3でサイレント端末の人口を目覚めさせるために使用することができます。
サイレントシナプスの可視化
- 細胞は蛍光顕微鏡を用いて離散シナプス端末の可視化を容易にするためにin vitroで10-14に一日でうまく区切り神経突起のプロセスで、比較的低密度を持つ必要があります。
- 蒸留水で5mMのFM1 - 43FXのストック溶液を準備します。株価は4℃暗所で維持されるべきである℃のFM1 - 43FXを使用してすべての実験はまた、暗所で行う必要があります。
- 100mM塩化ナトリウム、2mMの塩化カルシウム、1mMの塩化マグネシウム、10mMのグルコース、および10μMFM1 - 43FXを含むHEPES緩衝生理食塩水で45 mMの塩化カリウムで2分間の文化に挑戦。このソリューションはまた、シナプス後受容体を遮断し、再発性のシグナル伝達を防ぐために、1μMNBQXと25μMのD - APVが含まれている必要があります。この課題は、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスが可能なシナプス端子にラベルを付けます。チャレンジタイムと強度は、リサイクルのプールの4のすべての利用可能な小胞のエキソサイトーシスの少なくとも1ラウンドを引き起こすように設計されています。しかし、課題は、端末の追加のサイレンシングを引き起こすのに十分ではありません。
- 同じ塩化カリウムなく、生理食塩水HEPES緩衝が、500μMAdvasep - 7との非特異的色素5を削除するために使用して、わずか3〜5秒のために文化を洗ってください。このステップのタイミングは、すべてのFM1 - 43FXのラベルが失われますAdvasep - 7の長時間のアプリケーションとして重要であることに注意してください。 5つの2分間隔でAdvasep - 7なしで生理食塩水緩衝さHEPES内の次の洗浄。
- 10分間、4％パラホルムアルデヒドおよびPBS、pH7.4中0.2％グルタルアルデヒドで細胞を固定してください。一度簡単にPBSで細胞を洗浄し、次いでPBSで4％正常ヤギ血清、0.04％トリトンX - 100を含むブロッキング溶液で15分間反応させます。 FM1 - 43FXもトリトンX - 100はここと後のステップで使用される量に非常に敏感であることに注意してください。一般的に言えば、FM1 - 43FXのラベルは任意のトリトンX - 100がない場合に最適ですが、一部の洗剤には、その後の免疫染色のために、細胞を透過性が必要である。我々は0.04％のTriton X - 100は、シナプス前サイレントシナプスの検査のために最適化されている経験的に決定している。
- 1:2500の濃度でブロッキング溶液に一次vGluT - 1抗体を希釈します。室温で3時間vGluT - 1抗体希釈で穏やかに振盪/回転で細胞をインキュベートします。 FM1 - 43FXの染料の漂白を防ぐために箔を使用して、培養皿を覆うようにしてください。
- PBSで2回細胞を洗浄してから、2つの汚れを区別するためにFM1 - 43FXとは異なるスペクトル特性を持つ蛍光体に結合した抗モルモット抗体で細胞をインキュベートする。私たちの実験では、我々は、ブロッキング溶液で1:500でアレクサ555 -標識抗モルモット抗体を使用します。室温で30分間振とうしながら二次抗体で細胞をインキュベートする。
- 細胞をPBSで4回洗浄しFluoromount - Gの小さなドロップを使用してスライドガラス上にカバースリップをマウントします。細胞はスライドが手前になるように向きをカバースリップにしてください。スライドが一晩乾燥することができます。
- 我々は現在、アクティブと非アクティブなシナプスの画像を取得する準備が整いました。共焦点レーザー走査型顕微鏡1.4開口数で60 ×油の目標を準備します。カバースリップ側が客観的に直面していることを確認し、ステージ上でスライドを置きます。スライドを中心にした後、過度に密ではない神経突起のフィールドを探します。また、残留FM1 - 43FXの染料として、細胞体の近くに撮影を避けるために推奨されていても十分に洗浄した後、そこに残ることができる。我々の実験の画像の場合、我々は一般的に51 51ミクロンのフィールドの大きさに拡大します。
- 取得する27 0.3ミクロンの手順で7.8ミクロンの深さをカバーする特定のフィールドのZスタック。この範囲は、我々の文化の中で神経突起の厚さをカバーするのに十分です。 Z -スタック内の各ステップでは、顕微鏡の視野内のすべてのグルタミン酸作動性シナプスを識別するためvGluT - 1抗体の免疫蛍光励起レーザ光を最初のスキャン。同じフィールドは、FM1 - 43FXの蛍光のための各段階で再スキャンされます。信号の飽和を回避しながら、与えられた実験のためのすべてをカバーグラスの間で一貫して中立密度のフィルタリングと光電子増倍ゲインを設定します。我々は通常、各実験の条件ごと≥5のフィールドを取得する。
- 解析ソフトウェアを使用して、コンポジットシングルプレーンのイメージにZ -スタックを変換する。我々はこの変換に使用するプロセスは、各ピクセルでのあらゆる面からの最大の強度に基づいて画像を生成します。合成画像を閾値処理され、vGluT - 1の端子は、FM1 - 43FX染色を参照することなく、分析のために識別されます。涙点と呼ばれるステンドグラスエリアは、、関心領域としてマークされます。我々は通常、フィールドごとに10涙点を選択します。次にFM1 - 43FXのチャネルが閾値処理され、関心領域が重畳されています。解析ソフトウェアは、各シグナルの蛍光強度だけでなく、それぞれの涙の面積を定量化するために使用されます。絶対ピクセル基準または割合のピクセル基準は、非アクティブなシナプスからアクティブ区別するために使用することができます。
代表的な結果
- 私たちの文化では、我々はvGluT - 1染色で定義されているグルタミン酸シナプスの70-80％は、検出可能なFM1 - 43染色2、6-8で示すことがわかります。共局在マーカーとのシナプス：緑FM1 - 43蛍光と赤色vGluT - 1染色のオーバーレイ画像ではこれは黄色い涙点の豊富として反映されます。これらは、矢印で示されている。
- （赤）vGluT - 1陽性涙点の約20-30％がベースラインより上（緑）FM1 - 43蛍光を持つように失敗します。これらは、非アクティブなシナプス前終末であり、例は、矢印で示されます。
- シナプスの第三の人口も観察されます。これらは、（赤）vGluT - 1染色のFM1 - 43蛍光が欠けている（緑）のための肯定的です。これらは、アクティブなGABA作動性シナプスであり、例は、アスタリスクで示されます。これらは、我々の分析のほとんどから除外されますが、明示的vGluT - 1抗体の代わりに小胞性GABAトランスポーター抗体を用いて研究することができます。
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Discussion
意義
- 一般的にシナプスは、測定可能な確率で送信機を解放することによって動作すると考えられている。自分や他人が仕事では、小胞、神経伝達物質のトランスポーターやその他の重要なシナプスのマーカー2、6-8のフル装備にもかかわらず、いくつかのシナプスは神経伝達物質を放出する難治性であることがはっきりする。我々は、ニューロンの基底のネットワーク活動が非アクティブなシナプスのこの人口を維持するために重要であることが以前に示されている。
重要なステップ
- 500μMAdvasep - 7での簡単な洗浄を含めることは、著しくFM1 - 43FX染色の品質を向上させます。しかし、5秒以上この洗浄のタイミングのわずかな増加は、FM1 - 43FXのラベルが失われます。
- FM1 - 43FXは、トリトンX - 100プロトコルの免疫染色部分に使用される量に非常に敏感です。 FM1 - 43FXラベルは任意のトリトンX - 100がない場合に最適ですが、一部の洗剤はvGluT - 1免疫染色用の細胞を透過性が必要である。我々は0.4％トリトンX - 100は、シナプス前サイレントシナプスの検査のために最適化されている経験的に決定している。
変更
- 一つは、確実に染色第3として、シナプス後のマーカーを使用することができますvGluT - 1染色では、善意のシナプス表します：小胞を含んだ端末と後シナプス受容体のクラスター間の接触のポイントを。
- 一つは、また、汎シナプスマーカー、SV2、またはvGATなどの他のシナプス前の抗体マーカーを使用することを選択できます。
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Acknowledgments
この作品は、ワシントン大学にNIHの助成金DA018109とMH78823、およびNIH神経科学ブループリントコアグラントP30NS057105によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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