تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Summary

وسوف نظهر كيف يمكن تسجيل ردود فلاش من المخاريط ماوس واحدة باستخدام القطب الشفط.

Abstract

وقضيب مبصرات مخروط في شبكية العين هي المسؤولة عن الكشف عن الضوء. في الظلام ، ودوري النوكليوتيدات بوابات (CNG) القنوات في الجزء الخارجي مفتوحة وتسمح باستمرار تدفق الكاتيونات إلى الداخل عبر الغشاء ، depolarizing الخلية. التعرض للضوء مشغلات إغلاق قنوات الغاز الطبيعي المضغوط ، وكتل التدفق الداخل الموجبة الحالية ، وبالتالي يؤدي إلى فرط الاستقطاب الخلية. استنادا إلى قطبية مبصرات ، تم تطوير طريقة تسجيل الشفط في 1970s أنه ، خلافا للأسلوب الكلاسيكي التصحيح ، المشبك ، لا يتطلب اختراق غشاء البلازما

Protocol

صنع الأقطاب

1. جعل أقطاب تسجيل باستخدام مجتذب micropipette وتلميع كهربائي مع خيوط التسخين تحت المجهر. لتسجيل الماوس مخروط الشفط وحيدة الخلية ، وقطرها الداخلي على الطرف الكهربائي حوالي ميكرومتر 6-7.
2. إعداد أقطاب المرجعية. آغار تزن 1 ٪ في الماء المقطر. تذوب الحل أجار في حمام ماء ساخن. ملء ماصات زجاجية (L = 100 مم ، OD / ID = 1/0.75 ملم) مع آغار 1 ٪ باستخدام المحاقن. يصلب أجار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
3. قطع ماصات إلى نصفين باستخدام سكين الماس.
4. نقع الأقطاب المرجعية في حل مرجع ما لا يقل عن 24 ساعة في 4 درجات مئوية.

إعداد تجربة

5. التكيف مع الظلام ماوس في قفص الأسود بين عشية وضحاها.
6. إعداد 100 مل حل مرجع و 1 حل نضح L (أنظر أدناه) ، وتصفية الحل.
7. حل جيش صرب البوسنة 0،1 ٪ والجلوكوز 10 ملم في 20 مل حل المرجع.
8. معايرة كثافة ضوء مشجعا البصرية باستخدام مضواء.
9. جبل غرفة تسجيل على مرحلة من مراحل المجهر المقلوب.
10. فقاعة الحل نضح مع 95 ٪ O ₂ / 5 ٪ CO ₂ ، واحتضان في حمام مائي 40 ° C لزيادة ذوبان ثاني أكسيد الكربون _2. الحل ينبع من الزجاجة إلى غرفة تسجيل يمر السيراميك المقاوم الاحترار إلى 36-38 درجة مئوية. يجب أن يكون موجودا المدفأة أقرب إلى غرفة تسجيل وقت ممكن ، ويفضل في هذه المرحلة من المجهر.
11. ضبط منظم التدفق لمعدل تدفق حوالي 1-1،5 مل / دقيقة.
12. ملء القطب تسجيل مع حل المرجع. إدراج القطب في القطب حامل. تأكد من عدم وجود فقاعات في القطب. تركيب على حامل headstage من مكبر للصوت. توصيل حامل بجهاز شفط ، والتي بنيت من خلال ربط أنابيب مملوءة جزئيا مع الزيوت المعدنية إلى جانب منفذ لصاحب القطب. يتم توصيل الطرف الآخر من الأنبوب إلى خزان صغير من الزيوت المعدنية ، والتي يمكن تطبيقها على الضغط عن طريق الفم.
13. ربط الكهربائي إشارة إلى القطب الآخر من headstage. ربط الزوجين الحرارية (TC) إلى القطب المرجع. تأكد من وجود قطب ونصائح TC هي قريبة من بعضها البعض بحيث يتم أخذ القراءة درجة حرارة قريبة من الخلية ممكن.
14. بدوره على الأشعة تحت الحمراء لإنارة تصور القطب. ويعتبر القطب بواسطة كاميرا الأشعة تحت الحمراء إلى جهاز اتصال. مركز الصورة في الحقل الكهربائي البصرية وجهاز العرض باستخدام تتلاعب الدقيقة.
15. ضبط الموقف من وثيقة مرجعية غيض الكهربائي (2-4 ملم) إلى تسجيل غيض الكهربائي.
16. ضبط الجهد العاصمة للتدفئة ذلك أن درجة حرارة الحل هو حوالي 36-38 درجة مئوية.
17. تشغيل اختبار للتحقق من ختم مقاومة القطب التسجيل ، عادة حوالي 900 أوم.

عزل الشبكية الماوس

18. تحت ضوء أحمر خافت ، الموت ببطء الماوس داكنة تكييفها مع ثاني أكسيد الكربون ₍₂₎ وخلع عنق الرحم. بمناسبة مقل العيون باستخدام غيض من الشعلة المعدن الساخن قبل كيها النقطة الأكثر الظهرية للالصلبة قليلا. استأصل في مقل العيون باستخدام المقص. يتم تنفيذ كافة الإجراءات اللاحقة تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء.
19. Hemisect مقل العيون تحت المجهر مع إضاءة الأشعة تحت الحمراء والمحولات الصورة.
20. إزالة القرنية والعدسة. إزالة أكبر قدر من زجاجي ممكن.
21. لتسجيل ردود M - المخروط ، وإزالة جزء من بطني فنجان العين ⁴ بشفرة حلاقة الحكم من علامة الكي.
22. قشر الشبكية من طبقة الظهارة الصبغية.
23. تتسطح في الشبكية ووضعها على الجزء السفلي من طبق بيتري مليئة 1-2 حل مرجع مل.
24. شريحة الشبكية إلى قطع صغيرة رقيقة باستخدام شفرة حلاقة واحتضان إعداد في مربع الضوء محكم مشبع بالأكسجين النقي.

تسجيلات

25. إيقاف المدفأة مؤقتا. التبديل تدفق نضح إلى الأنابيب الالتفافية لمنع الغرفة من التجفيف.
26. نزوح أكثر من الحل في الغرفة باستخدام قطعة من النسيج Kimwipe. نقل تعليق الشبكية إلى غرفة تسجيل باستخدام ماصة الزجاج.
27. انتظر حوالي 2 دقيقة حتى تستقر شرائح شبكية العين. تبديل نضح مرة أخرى. تشغيل جهاز التدفئة.
28. بدوره على إضاءة الأشعة تحت الحمراء لإعداد تصور. بحث عن قطعة من شبكية العين ملقاة على غرفة مع شرائح مبصرة تخرج الخارجي (انظر الشكل سبيل المثال). رسم قطاعات الداخلية برفق في القطب بواسطة الشفط. في هذا التكوين ، ينبغي لفت نوى عدة وقطاعات الداخلية في القطب. سجل photoresponse إلى ومضة مشرقة لاختبار ما إذا كان الجزء المخروطي الداخلية في القطب ، وما إذا كانت الخلية شفاءخاصتك ، استنادا الى الاستجابة الحركية والسعة.
29. انخفاض الخزان المعدنية لتطبيق ضغط سلبي طفيف على غيض من القطب للمساعدة في عقد الجزء الداخلي في القطب.
30. سجل للتجارب فلاش الاستجابات من قاتمة لشدة مشرق بمجرد العثور على خلية جيدة. وتقدم ومضات من منشط اختبار بصري معايرة ^5. يتم التحكم في كثافة الفلاش والطول الموجي من خلال مجموعة من مرشحات الكثافة محايدة ، وتضييق نطاق التدخل المرشحات ، على التوالي. يتم التحكم اختبار فلاش مدة (20 مللي) عن طريق الكمبيوتر يحركها مصاريع.

الحلول

1. الماوس حل نضح : 112.5 ملي كلوريد الصوديوم ، و 3.6 ملي بوكل ، 2.4 ملي MgCl ₂ و 1.2 ملي CaCl ₂ ، 10 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة) ، و 20 ملي NaHCO ₃ ، 3 مم نا سكسينات ، 0.5 ملي نا الغلوتامات ، 0.02 مم EDTA ، و 10 ملي الجلوكوز.
2. حل الماوس الكهربائي التسجيل : كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 3.6 ملم بوكل ، 2.4 ملي MgCl ₂ و 1.2 ملي CaCl ₂ ، 3 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة) ، 0.02 مم EDTA.

Discussion

وقد وضعت وحيدة الخلية تسجيل الشفط من خلايا مستقبلة للضوء 3 عقود مضت. انها تمكننا من تسجيل عبر غشاء تغيير الحالي الناجم عن ضوء التحفيز دون اختراق غشاء الخلية. بسبب التصاق الخلية خلية عالية ، وأنه من الصعب عزل قضيب واحد صحي والمخروط من شبكية العين شبكية العين مثل الماوس البرمائيات وانه من الصعب العثور على المخاريط الفردية نظرا لانخفاض نسبة (3 ٪) وحجم صغير. الجزء الداخلي ، في (IS - في) طريقة تسجيل يتغلب على هذه الصعوبة من خلال تسجيل الحالي من شرائح الداخلية للمبصرات عدة ، من بينها يمكن إدراجها مخروط. اكتب الماوس في البرية ، وينبغي أن يكون الرد على مزيج من قضبان ومخاريط. ويمكن استخدام ضوء خلفية ثابتة لقمع ردود قضيب. في هذا الفيديو ، استخدمنا Tα / -- شبكية العين ، والتي لا يمكن قضبان الاستجابة لتحفيز الخفيفة ، لأنها تفتقر إلى وحدة فرعية α من البروتين transducin G - ^6. لذلك ، photoresponse فقط من المخاريط.