Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren

Summary

We zullen laten zien hoe te knipperen de reacties op te nemen van enkele muis kegels met behulp van een zuig-elektrode.

Abstract

Staafjes en kegeltjes fotoreceptoren in het netvlies zijn verantwoordelijk voor het licht detectie. In de duisternis, cyclisch nucleotide-gated (CNG) kanalen in de buitenste segment zijn open en laten kationen gestaag naar binnen stromen over het membraan, depolariserende de cel. Blootstelling aan licht leidt tot de sluiting van de CNG-kanalen, blokkeert de innerlijke kation stroom, en dus resulteert in een cel hyperpolarisatie. Op basis van de polariteit van fotoreceptoren, was een zuig-opname methode ontwikkeld in 1970 dat, in tegenstelling tot de klassieke patch-clamp techniek, vereist geen penetreren van de plasmamembraan

Protocol

Het maken van elektroden

1. Maak de registrerende elektroden met behulp van een micropipet trekker en poets de elektroden met verwarming gloeidraad onder de microscoop. Voor muis kegel eencellige zuig-opname, de binnenste diameter van de elektrode tip is ongeveer 6-7 um.
2. Bereid referentie-elektroden. Weeg 1% agar in gedistilleerd water. Smelt de agar-oplossing in warm water bad. Vul de glazen pipetten (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) met 1% agar met behulp van spuit. Stollen van de agar bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
3. Snijd de pipetten in twee helften met behulp van een diamant mes.
4. Genieten van de referentie-elektroden in de referentie-oplossing ten minste 24 uur bij 4 ° C.

Het opzetten van het experiment

5. Donker 's nachts een muis aan te passen in een zwarte kooi.
6. Bereiding van 100 ml referentie-oplossing en een L perfusie-oplossing (zie hieronder) en filter de oplossing.
7. Los 0,1% BSA en 10 mM glucose in 20 ml standaardoplossing.
8. Kalibreer de lichtintensiteit van de optische stimulator met behulp van fotometer.
9. Monteer de opname kamer op het podium van de omgekeerde microscoop.
10. Bubble van de perfusie-oplossing met 95% O ₂ / 5% CO _2, incubeer het in 40 ° C waterbad om de oplosbaarheid van CO ₂ te verhogen. De oplossing vloeit voort uit de fles om de opname kamer die door een keramische weerstand opwarming het naar 36-38 ° C. De verwarming moet zo dicht mogelijk bij de opname kamer mogelijk zijn, idealiter in het stadium van de microscoop.
11. Stel de debietregelaar voor een debiet van ongeveer 1-1,5 ml / min.
12. Vul de registratie-elektrode met referentie-oplossing. Plaats de elektrode in een elektrode houder. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de elektrode. Monteer de houder op de headstage van de versterker. Sluit de houder een zuiginrichting, die is gebouwd door het aansluiten van leidingen gedeeltelijk gevuld met minerale olie om de side-poort van de elektrode houder. Het andere uiteinde van de slang is verbonden met een klein reservoir van minerale olie, waarmee de druk kan worden toegepast door de mond.
13. Sluit de referentie-elektrode naar de andere pool van de headstage. Bind de thermische koppel (TC) om de referentie-elektrode. Zorg ervoor dat de elektrode en TC tips liggen dicht bij elkaar, zodat de temperatuur wordt genomen zo dicht mogelijk bij de cel mogelijk te maken.
14. Schakel de infrarood verlichting van de elektrode te visualiseren. De elektrode wordt bekeken door middel van infrarood-camera is aangesloten op een monitor. Midden van de elektrode beeld op het visuele veld en van de monitor met behulp van een micro-manipulator.
15. Pas de positie van de referentie-elektrode dicht (2-4 mm) om de opname elektrode tip.
16. Stel de DC-spanning voor de verwarming zodat de temperatuur van de oplossing is ongeveer 36-38 ° C.
17. Voer een dichtheidsbeproeving om de weerstand van de registratie-elektrode controleren, normaal ongeveer 900 kΩ.

Isoleren van de muis netvlies

18. Onder gedimd rood licht, euthanaseren het donker aangepaste muis met CO ₂ en cervicale dislocatie. Markeer de oogbollen met behulp van de punt van een hete metalen fakkel door verbranden van de meest dorsale punt van de sclera licht. Ophelderen de oogbollen met een schaar. Alle volgende procedures worden uitgevoerd onder infrarood licht.
19. Hemisect de oogbollen onder de microscoop met infrarood verlichting en beeldomzetters.
20. Verwijder het hoornvlies en de lens. Verwijder zoveel van het glasvocht mogelijk te maken.
21. Voor het opnemen van M-cone reacties, verwijder het ventrale deel van de oogschelp ⁴ met een scheermesje te oordelen naar de cauterisatie mark.
22. Schil het netvlies van het pigment epitheel laag.
23. Plat het netvlies en de plaats het op de bodem van de petrischaal gevuld met 1-2 mL referentie-oplossing.
24. Snijd het netvlies in kleine dunne stukjes met behulp van een scheermesje en incubeer de bereiding in een lichtdichte doos verzadigd met pure zuurstof.

Opnamen

25. Zet de verwarming tijdelijk. Schakel de perfusie stroom naar een bypass slang aan op de kamer te voorkomen drogen.
26. Giet het grootste deel van de oplossing in de kamer met behulp van een stukje Kimwipe weefsel. Overdracht het netvlies schorsing om de opname kamer met een glazen pipet.
27. Wacht ongeveer 2 minuten tot het netvlies plakken vestigen. Weer in te schakelen van de doorbloeding op. Schakel de verwarming.
28. Schakel infrarood verlichting aan de voorbereiding te visualiseren. Zoek naar een stukje van het netvlies liggen op de kamer met fotoreceptor buitenste segmenten uit te steken (zie voorbeeld figuur). Zuig binnenste segmenten in de elektrode door de zuiging. In deze configuratie moeten verschillende kernen en innerlijke segmenten worden getrokken in de elektrode. Noteer de photoresponse om een ​​heldere flits om te testen of een kegel innerlijke segment is in de elektrode, en of de cel is te genezenuw, te oordelen naar de reactie kinetiek en amplitude.
29. Laat de minerale reservoir tot lichte negatieve druk op de punt van de elektrode te helpen houden de binnenste segment in de elektrode toe te passen.
30. Record test-flash reacties van dim naar heldere intensiteit eens een goede cel is gevonden. Test flitsen zijn voorzien van een geijkte optische stimulator ^5. Flitsintensiteit en golflengte worden gecontroleerd door een reeks van neutrale dichtheid filters en de smalle band interferentie filters, respectievelijk. Test flash duur (20 ms) wordt bestuurd door de computer-gestuurde rolluiken.

Oplossingen

1. Muis perfusie oplossing: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM _MgCl2, 1,2 mM _CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO _{3, 3} mM Na succinaat, 0,5 mM Na glutamaat, 0,02 mM EDTA, en 10 mM glucose.
2. Muis registratie-elektrode-oplossing: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM _MgCl2, 1,2 mM CaCl _2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA.

Discussion

Single-cell zuig opname van fotoreceptorcellen was drie decennia geleden ontwikkeld. Het stelt ons in staat om op te nemen trans-membraan huidige verandering veroorzaakt door licht stimulatie, zonder het penetreren van de celmembraan. Vanwege de hoge cel-cel adhesie, is het moeilijk om gezond single staafjes en kegeltjes isoleren van de muis netvlies, zoals amfibieën retina en het is moeilijk te vinden individuele kegels te wijten aan het lage percentage (3%) en de kleine omvang. De binnenste-segment-in (IS-in) opname methode ondervangt dit probleem door het opnemen van stroom van de binnenste segmenten van verschillende fotoreceptoren, waaronder een kegel zou kunnen worden opgenomen. In wild-type muis, moet de reactie worden de combinatie van de staafjes en kegeltjes. Een stabiele achtergrond licht kan worden gebruikt om de stang reacties te onderdrukken. In deze video, gebruikten we Tα-/ - netvlies, waarin de staafjes niet kan reageren op licht stimulatie, omdat ze niet de α-subunit van het G-eiwit transducin ^6. Daarom is de photoresponse is alleen van kegels.