Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Summary

Wir werden zeigen, wie man Flash-Antworten von einfachen Mausklick Kegel mit einem Saug-Elektrode aufnehmen.

Abstract

Rod und Zapfen-Photorezeptoren in der Netzhaut sind verantwortlich für light detection. In der Dunkelheit sind zyklisch Nukleotid-gesteuerten (CNG)-Kanäle in das äußere Segment offen und ermöglichen Kationen stetig nach innen fließen durch die Membran, depolarisierende der Zelle. Belichtung löst die Schließung des CNG-Kanäle, die Blöcke der inneren Kationen Stromfluss und damit Ergebnisse in Zelle Hyperpolarisation. Basierend auf der Polarität von Photorezeptoren, wurde eine Saug-Aufnahme-Methode in den 1970er Jahren, dass, im Gegensatz zu den klassischen Patch-Clamp-Technik, nicht erforderlich ist Eindringen in die Plasmamembran entwickelt

Protocol

Herstellung von Elektroden

1. Machen Sie die Aufnahme Elektroden mit einer Mikropipette Abzieher und polieren Sie die Elektroden mit Heizdraht unter dem Mikroskop. Für Maus Kegel Single-Cell-Saug-Aufnahme wird der innere Durchmesser der Elektrodenspitze ca. 6-7 um.
2. Bereiten Referenzelektroden. Wiegen Sie 1% Agar in destilliertem Wasser. Schmelzen Sie die Agar-Lösung in heißen Wasserbad. Füllen Sie das Glas Pipetten (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) mit 1% Agar mit Spritze. Festigen der Agar bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
3. Schneiden Sie die Pipetten in zwei Hälften mit einem Diamant-Messer.
4. Weichen Sie die Referenz-Elektroden in Bezug Lösung für mindestens 24 Stunden bei 4 ° C.

Einrichten des Tests

5. Dunkle anzupassen einer Maus in einem schwarzen Käfig über Nacht.
6. Bereiten Sie 100 mL Referenz-Lösung und 1 L Perfusionslösung (siehe unten) und filtrieren.
7. Man löst 0,1% BSA und 10 mM Glucose in 20 mL Referenzlösung.
8. Kalibrieren Sie die Lichtintensität der optischen Stimulator mit Photometer.
9. Montieren Sie die Aufnahme Kammer auf der Bühne des inversen Mikroskop.
10. Blase die Perfusionslösung mit 95% O ₂ / 5% CO ₂ inkubieren es in 40 ° C Wasserbad, um die Löslichkeit von CO ₂ zu erhöhen. Die Lösung fließt aus der Flasche, um die Aufnahme Kammer durch einen keramischen Widerstand Erwärmen auf 36-38 ° C. Die Heizung sollte möglichst nahe an der Aufnahme Kammer wie möglich, idealerweise in der Phase des Mikroskops liegen.
11. Passen Sie den Durchflussregler für einen Volumenstrom von ca. 1-1,5 mL / min.
12. Füllen Sie die Aufnahme-Elektrode mit Referenz-Lösung. Legen Sie die Elektrode in einen Elektrodenhalter. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der Elektrode. Montieren Sie die Halterung auf der headstage des Verstärkers. Schließen Sie die Halterung an eine Absaugvorrichtung, die von Verbindungsschlauch teilweise mit Mineralöl auf die Seite-Port des Elektrodenhalter gefüllt gebaut wird. Das andere Ende des Schlauches ist zu einem kleinen Reservoir von Mineralöl verbunden, an dem Druck durch den Mund eingesetzt werden.
13. Schließen Sie die Referenz-Elektrode mit dem anderen Pol der headstage. Binden Sie die Thermoelement (TC) auf die Referenz-Elektrode. Sicherstellen, dass die Elektrode und TC Tipps sind nahe beieinander, so dass die Temperaturanzeige so nah an der Zelle wie möglich getroffen werden.
14. Schalten Sie den Infrarot-Beleuchtung, um die Elektrode zu visualisieren. Die Elektrode wird durch Infrarot-Kamera an einen Monitor. Zentrum der Elektrode Bild auf das Gesichtsfeld und der Monitor mit einem Mikro-Manipulator.
15. Passen Sie die Position der Referenzelektrode Spitze nahe (2-4 mm), um die Aufnahme Elektrodenspitze.
16. Stellen Sie die DC-Spannung für die Heizung, so dass die Temperatur der Lösung beträgt etwa 36-38 ° C.
17. Run eine Dichtheitsprüfung, um den Widerstand der Aufnahme Elektrode überprüfen, in der Regel ca. 900 kOhm.

Isolieren Sie die Maustaste Netzhaut

18. Unter dim rotes Licht, euthanize Dunkeln angepasst Maus mit CO ₂ und Genickbruch. Markieren Sie die Augäpfel mit der Spitze eines heißen Metalls Fackel durch Ausbrennen der dorsale Punkt der Sklera leicht. Entkernen die Augäpfel mit einer Schere. Alle nachfolgenden Verfahren sind unter Infrarot-Licht durchgeführt.
19. Hemisect die Augäpfel unter dem Mikroskop mit Infrarot-Beleuchtung und Bildwandler.
20. Entfernen Sie die Hornhaut und Linse. Entfernen Sie so viel von dem Glaskörper wie möglich.
21. Zur Aufnahme M-Kegel Antworten, entfernen Sie die ventralen Teil der Augenmuschel ⁴ mit einer Rasierklinge die Beurteilung aus dem Kauter zu markieren.
22. Peel die Netzhaut vom Pigmentepithel Schicht.
23. Flatten der Netzhaut und stelle sie auf den Boden der Petrischale mit 1-2 ml Referenzlösung gefüllt.
24. Scheiben der Netzhaut in kleine dünne Stücke mit einer Rasierklinge und inkubieren Sie die Zubereitung in einem lichtdichten Gehäuse mit reinem Sauerstoff gesättigt.

Recordings

25. Schalten Sie die Heizung vorübergehend. Schalten Sie die Perfusion Strömung zu einem Bypass-Schlauch, um die Kammer vor dem Austrocknen zu verhindern.
26. Lassen Sie die meisten der Lösung in die Kammer mit einem Stück Kimwipe Gewebe. Übertragen Sie die Netzhaut Federung, um die Aufnahme Kammer mit einer Glaspipette.
27. Warten Sie ca. 2 Minuten, bis die Netzhaut Scheiben nieder. Schalten Sie die Durchblutung wieder an. Schalten Sie die Heizung.
28. Schalten Sie Infrarot-Beleuchtung für die Vorbereitung zu visualisieren. Suche nach einem Stück der Netzhaut liegen auf der Kammer mit Photorezeptor äußeren Segmente herausragen (siehe Beispiel Abbildung). Draw inneren Segmente sanft in die Elektrode durch Absaugen. In dieser Konfiguration sollte mehrere Kerne und inneren Segmente in die Elektrode gezogen werden. Notieren Sie sich die Photoreaktion zu einem hellen Blitz zu testen, ob ein Kegel innere Segment in der Elektrode ist und ob die Zelle zu heilendein, die Beurteilung durch die Reaktion Kinetik und Amplitude.
29. Senken Sie den Mineral-Reservoir zu leichten Unterdruck an der Spitze der Elektrode zu helfen, halten Sie die innere Segment in der Elektrode gelten.
30. Rekord-Test-Flash-Reaktionen zwischen schwach und stark Intensität einmal eine gute Zelle gefunden wird. Testen Blitze aus einer kalibrierten optischen Stimulator ⁵ vorgesehen. Flash-Intensität und Wellenlänge sind durch eine Reihe von Neutralfilter und Schmalband-Interferenzfilter gesteuert. Testen Sie Blitzdauer (20 ms) wird vom Computer-gesteuerte Jalousien gesteuert.

Lösungen

1. Maus Perfusionslösung: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO _3, 3 mM Na-Succinat, 0,5 mM Na Glutamat, 0,02 mM EDTA, und 10 mM Glukose.
2. Maus Aufzeichnung Elektrode Lösung: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA.

Discussion

Einzel-Zell-Saug-Aufnahme von Sehzellen war 3 Jahrzehnten entwickelt. Es ermöglicht uns, trans-Membran Stromänderung durch Licht Stimulation ohne die Zellmembran überwinden induzierte aufzunehmen. Wegen der hohen Zell-Zell-Adhäsion, ist es schwierig, gesunde einzelnen Stäbchen und Zapfen von der Maus Netzhaut wie Amphibien Netzhaut zu isolieren und es ist schwer, einzelne Zapfen aufgrund der geringen Prozentsatz (3%) und kleine Größe zu finden. Die Innen-Segment-in (IS-in)-Aufzeichnungsverfahren überwindet diese Schwierigkeit durch die Aufnahme von der inneren Segmente von mehreren Photorezeptoren, unter denen ein Kegel aufgenommen werden könnte Strom. In Wildtyp-Maus, sollte die Antwort der Kombination aus Stäbchen und Zapfen werden. Ein stetiger Hintergrundbeleuchtung verwendet, um die Stange Reaktionen zu unterdrücken. In diesem Video haben wir Tα-/ - Retina, in denen Stäbe nicht ans Licht Stimulation reagieren können, da sie die α-Untereinheit des G-Proteins Transducin ^6. Mangel. Daher ist die Photoreaktion nur aus Zapfen.