Summary
हम दिखा देंगे कि कैसे एक माउस एक चूषण इलेक्ट्रोड का उपयोग शंकु से फ्लैश प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए.
Abstract
रेटिना में रॉड और कोन photoreceptors प्रकाश का पता लगाने के लिए जिम्मेदार हैं. अंधेरे में, बाहरी खंड में चक्रीय nucleotide-gated चैनलों (सीएनजी) खुले हैं और फैटायनों प्रवाह करने के लिए तेजी से अंदर की ओर झिल्ली भर, depolarizing सेल की अनुमति. लाइट जोखिम सीएनजी चैनल, आवक कटियन वर्तमान प्रवाह ब्लॉक, और इस प्रकार सेल hyperpolarization में परिणाम बंद हो सके. Photoreceptors के polarity के आधार पर, एक चूषण रिकॉर्डिंग विधि है कि, क्लासिक पैच - दबाना तकनीक के विपरीत, प्लाज्मा झिल्ली मर्मज्ञ की आवश्यकता नहीं है 1970 के दशक में विकसित किया गया था
Protocol
इलेक्ट्रोड बनाना
- रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक micropipette खींचने का उपयोग करें और खुर्दबीन के नीचे हीटिंग फिलामेंट के साथ इलेक्ट्रोड पॉलिश. माउस शंकु चूषण एकल कक्ष रिकॉर्डिंग के लिए, इलेक्ट्रोड टिप पर भीतरी व्यास 6-7 सुक्ष्ममापी के बारे में है.
- संदर्भ इलेक्ट्रोड तैयार. आसुत जल में 1% अगर वजन. गर्म पानी से स्नान में अगर समाधान पिगलो. % 1 अगर सिरिंज का उपयोग कर के साथ कांच pipettes (एल = 100 मिमी आयुध डिपो / आईडी = 1/0.75 मिमी) भरें. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अगर जमना.
- एक हीरे की चाकू का उपयोग हिस्सों में कट pipettes.
- कम से कम 24 घंटे के लिए 4 में संदर्भ के समाधान के संदर्भ में इलेक्ट्रोड भिगोएँ डिग्री सेल्सियस
प्रयोग की स्थापना
- एक काले पिंजरे में डार्क माउस रातोंरात अनुकूलन.
- 100 एमएल संदर्भ समाधान और 1 एल छिड़काव समाधान (नीचे देखें) तैयार करें और फिल्टर समाधान.
- 0.1% BSA और 20 एमएल संदर्भ समाधान में 10 मिमी ग्लूकोज भंग.
- ऑप्टिकल photometer का उपयोग उत्तेजक औधधि के प्रकाश की तीव्रता जांचना.
- उलटा माइक्रोस्कोप के मंच पर रिकॉर्डिंग कक्ष माउंट.
- 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ बुलबुला छिड़काव समाधान, यह 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते सीओ 2 की विलेयता में वृद्धि. समाधान बोतल से रिकॉर्डिंग एक चीनी मिट्टी रोकनेवाला यह 36-38 के लिए वार्मिंग के माध्यम से गुजर चैम्बर ° सी. करने के लिए बहती है हीटर माइक्रोस्कोप के स्तर पर संभव के रूप में आदर्श रिकॉर्डिंग कक्ष में बंद के रूप में स्थित होना चाहिए.
- 1-1.5 के बारे में एमएल / मिनट की एक प्रवाह की दर के लिए प्रवाह नियामक समायोजित करें.
- संदर्भ समाधान के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भरें. एक इलेक्ट्रोड धारक में इलेक्ट्रोड डालें. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड में कोई बुलबुले हैं. एम्पलीफायर के headstage पर धारक माउंट. धारक को एक चूषण डिवाइस है, जो आंशिक रूप से खनिज तेल के साथ इलेक्ट्रोड धारक के पक्ष पोर्ट से भरा टयूबिंग जोड़ने के द्वारा बनाया गया है करने के लिए कनेक्ट. टयूबिंग के दूसरे छोर खनिज तेल के एक छोटे से जलाशय के लिए जुड़ा हुआ है, मुंह से दबाव लागू किया जा सकता है.
- Headstage के अन्य पोल संदर्भ इलेक्ट्रोड कनेक्ट. संदर्भ इलेक्ट्रोड थर्मल जोड़े (टीसी) बाँध. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड और टीसी सुझावों करीब एक साथ तो यह है कि तापमान पढ़ने के रूप में लिया जाता है संभव के रूप में सेल के करीब हैं.
- अवरक्त प्रदीप्ति पर मुड़ें करने के लिए इलेक्ट्रोड कल्पना. इलेक्ट्रोड एक मॉनिटर से जुड़े अवरक्त कैमरे द्वारा देखा जाता है. दृश्य क्षेत्र और एक सूक्ष्म जोड़तोड़ का उपयोग निगरानी के केंद्र इलेक्ट्रोड छवि.
- संदर्भ इलेक्ट्रोड टिप रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड टिप करने के लिए करीब (2-4 मिमी) की स्थिति को समायोजित करें.
- हीटर के लिए डीसी वोल्टेज को समायोजित इतना है कि समाधान के तापमान डिग्री सेल्सियस 36-38 के बारे में है
- मुहर परीक्षण चलाने के 900 kΩ के बारे में आम तौर पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध, जाँच.
माउस रेटिना अलग
- मंद लाल बत्ती के तहत, सीओ 2 और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ काले अनुकूलित माउस euthanize . श्वेतपटल की सबसे पृष्ठीय बिंदु थोड़ा cauterizing द्वारा एक गर्म धातु मशाल के टिप का उपयोग कर आंखों मार्क. कैंची का उपयोग आंखों पता लगाना. बाद में सभी प्रक्रियाओं अवरक्त प्रकाश के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं.
- अवरक्त रोशनी और छवि कन्वर्टर्स के साथ खुर्दबीन के नीचे नेत्रगोलक Hemisect.
- कॉर्निया और लेंस निकालें. के रूप में संभव के रूप में शीशे की ज्यादा निकालें.
- एम शंकु प्रतिक्रियाएं रिकॉर्ड करने के लिए, एक रेजर ब्लेड के साथ दाग़ना निशान से पहचानने 4 eyecup के उदर भाग को हटा दें.
- वर्णक उपकला परत से रेटिना पील.
- रेटिना समतल और 1-2 एमएल संदर्भ समाधान के साथ भरा पेट्री डिश के तल पर यह जगह.
- छोटी सी पतली धार का उपयोग टुकड़ों में रेटिना स्लाइस और एक प्रकाश तंग शुद्ध ऑक्सीजन के साथ संतृप्त बॉक्स में तैयारी सेते हैं.
रिकॉर्डिंग
- अस्थायी रूप से बंद हीटर मुड़ें. एक बाईपास टयूबिंग छिड़काव प्रवाह स्विच के सूखने से चैम्बर रोकने के.
- Kimwipe ऊतक का एक टुकड़ा का उपयोग कर कक्ष में समाधान का सबसे नाली. रिकॉर्डिंग कक्ष के लिए एक गिलास पिपेट का उपयोग रेटिना निलंबन स्थानांतरण.
- के बारे में 2 मिनट के लिए रुको जब तक रेटिना स्लाइस बसने. छिड़काव वापस स्विच पर. हीटर पर मुड़ें.
- अवरक्त प्रदीप्ति पर मुड़ें तैयारी कल्पना. फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों के बाहर चिपके हुए (उदाहरण आंकड़ा देखें) के साथ चैम्बर पर झूठ बोल रेटिना का एक टुकड़ा के लिए खोज. चूषण द्वारा इलेक्ट्रोड में भीतरी क्षेत्रों धीरे ड्रा. इस विन्यास में, कई नाभिक और भीतरी क्षेत्रों इलेक्ट्रोड में तैयार किया जाना चाहिए. एक उज्ज्वल फ्लैश photoresponse परीक्षण है कि क्या एक शंकु के भीतर खंड इलेक्ट्रोड में है और है कि क्या कक्ष चंगा है रिकार्डतेरा, प्रतिक्रिया कैनेटीक्स और आयाम को देखते.
- खनिज जलाशय निचले मामूली इलेक्ट्रोड की टिप करने के लिए नकारात्मक दबाव में मदद करने के लिए इलेक्ट्रोड में भीतरी खंड पकड़ लागू.
- परीक्षण फ़्लैश कीर्तिमान प्रतिक्रियाओं से उज्ज्वल तीव्रता मंद एक बार एक अच्छी सेल पाया जाता है. टेस्ट चमक एक calibrated ऑप्टिकल 5 उत्तेजक औधधि से प्रदान की जाती हैं. फ़्लैश तीव्रता और तरंग दैर्ध्य तटस्थ घनत्व फिल्टर और संकीर्ण बैंड हस्तक्षेप के फिल्टर के एक सेट के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं क्रमशः. टेस्ट फ़्लैश अवधि (20 ms) कंप्यूटर संचालित बंद द्वारा नियंत्रित किया जाता है.
समाधान
- माउस का छिड़काव समाधान: 112.5 मिमी NaCl, 3.6 मिमी KCl, 2.4 मिमी 2 MgCl, 1.2 मिमी 2 CaCl, 10 मिमी HEPES (7.4 पीएच), 20 मिमी NaHCO 3, 3 मिमी ना succinate, 0.5 मिमी ना ग्लूटामेट, 0.02 मिमी EDTA, और 10 मिमी ग्लूकोज.
- माउस रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड समाधान: 140 मिमी NaCl, 3.6 मिमी KCl, 2.4 मिमी 2 MgCl, 1.2 मिमी 2 CaCl, 3 मिमी HEPES (7.4 पीएच), 0.02 मिमी EDTA.
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Discussion
एकल कक्ष फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं से चूषण रिकॉर्डिंग 3 दशक पहले विकसित किया गया था. यह हमें सक्षम बनाता पार झिल्ली वर्तमान कोशिका झिल्ली मर्मज्ञ बिना प्रकाश उत्तेजना से प्रेरित परिवर्तन रिकॉर्ड है. उच्च आसंजन सेल सेल की वजह से, यह मुश्किल है उभयचर रेटिना की तरह माउस रेटिना से स्वस्थ एकल रॉड और कोन अलग और व्यक्तिगत शंकु कम प्रतिशत (3%) और छोटे आकार की वजह से मिल यह कठिन है. खंड के भीतर है में () रिकॉर्डिंग विधि कई photoreceptors, जो बीच में एक शंकु शामिल हो सकता है के भीतरी क्षेत्रों से वर्तमान रिकॉर्डिंग से इस कठिनाई पर काबू पा. जंगली प्रकार माउस में, प्रतिक्रिया rods और शंकुओं से संयोजन होना चाहिए. एक स्थिर पृष्ठभूमि प्रकाश रॉड प्रतिक्रियाओं को दबाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रेटिना, जिसमें छड़ प्रकाश उत्तेजना को जवाब नहीं है, के रूप में वे जी प्रोटीन 6 transducin के α-सबयूनिट की कमी कर सकते हैं - इस वीडियो में, हम Tα / इस्तेमाल किया. इसलिए, photoresponse शंकु से ही है.
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Acknowledgments
अनुसंधान से कैरियर विकास पुरस्कार के द्वारा समर्थित अनुसंधान से दृष्टिहीनता, NIH अनुदान 019312 EY, और अप्रतिबंधित अनुदान को रोकने के लिए दृष्टिहीनता और 02,687 EY (वाशिंगटन विश्वविद्यालय में नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान विभाग) रोकें.
References
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