マウスの錐体光受容体からの単一細胞サクション録音

Summary

我々は、吸引電極を用いてマウスのシングルコーンからフラッシュの応答を記録する方法を説明します。

Abstract

網膜の桿体と錐体光受容体は、光検出のための責任があります。暗闇の中で、外側のセグメントにおける環状ヌクレオチド依存性（CNG）チャネルが開いていて、陽イオンが細胞を脱分極、膜を横切って内側に着実に流れるようになります。光露光では、CNGチャネル、ブロック内向きの陽イオン電流の流れ、および従って細胞過分極の結果の閉鎖をトリガします。光受容体の極性に基づいて、吸引の記録方式は、古典的パッチクランプ法とは異なり、原形質膜を貫通する必要がない、1970年代に開発された

Protocol

電極を作る

1. マイクロピペットプラーを使用して、記録電極を作成し、顕微鏡下で加熱フィラメントと電極を磨く。マウスの錐体単一細胞吸引録音の場合、電極先端の内径は6-7μm程度である。
2. 参照電極を準備する。蒸留水で1％の寒天を量る。湯浴の寒天液を溶かす。シリンジを用いて1％の寒天をガラスピペットを（L = 100 mmの外径/ ID = 1/0.75 mm）を記入します。 10分間室温で寒天を固める。
3. ダイヤモンドナイフを使用して半分にピペットをカット。
4. 4℃で少なくとも24時間は、基準溶液中での参照電極を浸し℃に

実験のセットアップ

5. 暗い晩黒ケージでマウスを適応させる。
6. 100 mLの標準液と1リットルの灌流液を（下記参照）を準備し、ソリューションをフィルタリングする。
7. 0.1％BSA、20 mLの標準液中の10mMグルコースを溶解する。
8. 光度計を用いた光刺激装置の光強度を校正します。
9. 倒立顕微鏡のステージ上で録音室をマウントします。
10. 95％O ₂ / 5％CO ₂のバブル灌流液は、CO ₂の溶解度を高めるために40 ° Cの水浴中でインキュベートする。解決策は、ボトル36から38に加温し、セラミック抵抗を通過する記録チャンバー℃に流れるヒーターは、理想的に顕微鏡の段階で、可能な限りの記録室の近くに配置する必要があります。
11. 1〜1.5程度mL /分の流量のフローレギュレータを調整します。
12. 参照溶液と記録電極を埋める。電極ホルダに電極を挿入します。電極内に気泡がないことを確認します。アンプのヘッドステージ上にホルダーをマウントします。部分的に電極ホルダーのサイドポートにミネラルオイルを充填したチューブを接続することによって構築されている吸引装置、にホルダーを接続してください。チューブのもう一方の端は口の中でどの圧力を適用することができるため、鉱物油の小さなタンクに接続されている。
13. ヘッドステージの他の極に参照電極を接続してください。参照電極に熱カップル（TC）をバインドします。電極とTCのヒントが接近して温度の読み取りが可能な限り細胞に近いとみなされるようになっていることを確認します。
14. 電極を視覚化する赤外線照明の電源を入れます。電極は、モニターに接続されている赤外線カメラによって表示されます。視野上で、マイクロマニピュレータを用いてモニターの中心電極画像。
15. 記録電極の先端への参照電極の先端に近い（2-4 mm）の位置を調整します。
16. 溶液の温度が36から38℃程度になるようにヒータのDC電圧を調整する
17. 通常、900kΩの約、記録電極の抵抗をチェックするためにシールのテストを実行します。

マウスの網膜を分離

18. 暗赤色灯の下で、CO ₂と頚椎脱臼で暗順応マウスを安楽死させる。やや強膜の最も背点を焼灼による溶銑のトーチの先端を使って眼球をマーク。はさみを使って眼球を摘出。後続のすべての手順は、赤外光の下で実行されます。
19. 赤外線照明と画像コンバータと顕微鏡下での眼球を二等分する。
20. 角膜とレンズを取り外します。できるだけ硝子体をできるだけ多く削除します。
21. M -錐体の応答を記録するには、焼灼マークから判断してかみそりの刃でアイカップ⁴の腹側部分を削除してください。
22. 色素上皮層から網膜ピール。
23. 網膜を平らに1〜2 mLの標準液で満たされたペトリ皿の底の上に置きます。
24. カミソリの刃を使用して、小さな薄い部分に網膜をスライスし、純酸素で飽和遮光ボックスの準備をインキュベートする。

レコーディング

25. 一時的にヒーターの電源を切ります。乾燥室を防ぐためにバイパス管に血流の流れを切り替える。
26. キムワイプ組織片を用いてチャンバー内の溶液のほとんどを排出します。ガラスピペットを使用して録音室に網膜の懸濁液を移す。
27. 網膜のスライスが落ち着くまで、約2分間待ちます。背面の血流を切り替えます。ヒーターの電源を入れます。
28. 準備を視覚化する赤外線照明の電源を入れます。突き出光受容体の外側のセグメントでチャンバーの上に横たわっ網膜の部分のための検索（例の図を参照）。吸引によって電極に軽く内側のセグメントを描画します。この構成では、いくつかの核と内側のセグメントは、電極に描画する必要があります。円錐内部セグメントが電極内にあるかどうかと、セルが治癒されているかどうかをテストするために明るいフラッシュに光応答を記録汝、応答速度と振幅によって判断する。
29. 電極の内側のセグメントを保持するための電極の先端にわずかな負圧を適用するには、ミネラルの貯水池を下ろします。
30. 薄暗いから明るい強度への記録テストフラッシュ応答良好な細胞が発見されれば。テストの点滅は、校正済み光刺激装置⁵から提供されています。フラッシュの強度と波長はそれぞれ、NDフィルターと狭帯域の干渉フィルターのセットによって制御されています。テスト発光持続時間（20ミリ）は、コンピュータ主導のシャッターで制御されます。

ソリューション

1. マウスの灌流液：112.5 mMのNaCl、3.6 mMの塩化カリウム、2.4 mMのMgCl _2、1.2 mMのCaCl _2を 、10mMのHEPES（pH7.4）を、20mMのNaHCO _3を 、3 mMのコハク酸ナトリウム、0.5mMのナトリウムグルタミン酸、0.02mMのEDTA、および10mMのグルコース。
2. マウスの記録電極液：140 mMのNaCl、3.6 mMの塩化カリウム、2.4 mMのMgCl _2、1.2 mMのCaCl _2を 、3 mMのHEPES（pH7.4）に、0.02mMのEDTA。

Discussion

視細胞から単一細胞吸引の記録は3年前に開発されました。それは細胞膜を貫通することなく、光刺激により誘発される膜貫通電流変化を記録することを可能にします。が高いために細胞間接着のために、それは両生類の網膜のようなマウスの網膜から健康なシングルロッドとコーンを分離することは困難であり、それは低い割合（3％）と小さいサイズのため、個々の錐体を見つけるのは難しいです。内側のセグメントイン（IS -で）記録方式は、コーンが含まれている場合がありますそのうち、いくつかの光受容体の内側のセグメントから現在記録することによって、この困難を克服しています。野生型マウスでは、応答がロッドとコーンの組み合わせでなければなりません。安定した背景光はロッドの応答を抑制するために使用することができます。網膜、彼らはGタンパク質トランスデューシン⁶のα-サブユニットを欠くようにロッドは、光刺激に反応できないような-このビデオでは、我々はTα- /を使用する。そのため、光応答は円錐からです。