Summary
Cette procédure décrit une méthode pour l'isolement et la culture de l'organe de Corti murin avec ou sans le limbe en spirale et les neurones du ganglion spiral. Nous démontrons également une méthode pour l'expression d'un gène rapporteur exogènes dans l'organe de Corti explant par électroporation.
Abstract
Dans tous les mammifères, l'épithélium sensoriel de l'audition est situé le long de l'organe de Corti en spirale qui réside dans la cochlée en forme de conque de l'oreille interne (figure 1). Les cellules ciliées de la cochlée de développement, qui sont les cellules mécano du système auditif, sont alignés dans une rangée de cellules ciliées internes et trois (dans la base et la mi-tours) à quatre (dans le tour apical) des rangées de cellules ciliées externes qui couvrent la longueur de l'organe de Corti. Les cellules ciliées transduire sonores induites par des vibrations mécaniques de la membrane basilaire en impulsions nerveuses que le cerveau peut interpréter. La plupart des cas de surdité de perception sont causés par la mort ou un dysfonctionnement des cellules ciliées de la cochlée.
Un outil de plus en plus essentiel dans la recherche auditif est l'isolement et la culture in vitro de l'explant 1,2,9 orgue. Une fois isolés, les explants peuvent être utilisées de plusieurs manières de fournir des informations concernant normatives, anormal, ou de la physiologie thérapeutiques. L'expression des gènes, la motilité stéréocils, biologie cellulaire et moléculaire, ainsi que les approches biologiques pour la régénération des cellules de cheveux sont des exemples d'applications expérimentales de l'organe d'explants Corti.
Ce protocole décrit une méthode pour l'isolement et la culture de l'organe de Corti de souris néonatales. La vidéo d'accompagnement comprend des directions pas à pas pour l'isolement de l'os temporal du souriceaux, et l'isolement ultérieur de la cochlée, ligament spiral et organe de Corti. Une fois isolé, l'épithélium sensoriel peut être plaqué et cultivées in vitro dans son intégralité, ou comme un autre micro-disséqués isoler ce manque de la spirale et limbe des neurones du ganglion spiral. En utilisant cette méthode, les explants primaires peut être maintenue pendant 7-10 jours. Comme exemple de l'utilité de cette procédure, l'organe de Corti explants sera électroporation avec une gène rapporteur DsRed exogènes. Cette méthode permet une amélioration par rapport aux autres méthodes publiées, car elle fournit des indications reproductibles, sans ambiguïté, et par étapes pour l'isolement, la microdissection et culture primaire de l'organe de Corti.
Protocol
Jour 1. Stérilisation et du revêtement des lamelles de verre.
- Dry stériliser les lamelles de microscope en verre dans un autoclave.
- Placez les lamelles stérilisés dans deux puits d'une pré-stérilisés de quatre puits boîte de culture cellulaire.
- Enduire les lamelles avec 1:1 poly-L-ornithine et de laminine complété avec 20% sérum de veau fœtal (SVF) pendant la nuit à 4 ° C.
- 400 ul de poly-L-ornithine (solution à 0,01% conservés à 4 ° C)
- 400 uL laminine (50 pg / ml de solution concentrée conservée en aliquots à -20 ° C)
- 200 uL de FBS (stockées en aliquots à -20 ° C)
- Heat-stériliser les outils de dissection nuit dans un incubateur à 150 ° C.
- Faire un milieu de culture contenant du sérum de 10% et 10 mg / ml d'ampicilline.
- 90 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium
- 5 ml de FBS (stockées en aliquots à -20 ° C)
- 5 ml de sérum de cheval (stockées en aliquots à -20 ° C)
- 10 uL ampicilline (10 mg / ml solution stock entreposé à 4 ° C)
Jour 2. L'isolement de l'organe de Corti.
- Stériliser la hotte à flux positifs de dissection.
- allumez la lumière UV pendant 20 min
- pulvériser toutes les surfaces avec de l'éthanol 70% et attendre 5 minutes avant utilisation.
- Décapitez souris chiot (P4) à la base du foramen magnum avec des ciseaux d'exploitation.
- Rincer brièvement la tête de 10 cm contenant plat éthanol à 70%.
- Enlever l'épiderme à l'aide d'un scalpel.
- Ouvrez la boîte crânienne le long de la suture sagittale en utilisant une lame de scalpel puis coupent le prosencéphale. Conservez le prosencéphale caudale pour la dissection plus loin.
- Retirez le prosencéphale, le cervelet et le tronc cérébral à l'aide dissection.
- Retirer l'os temporal (figure 2A), les tremper brièvement dans de l'éthanol à 70%, et les transférer sur un plat de 3 mm contenant HBSS stérile.
- En utilisant des pinces, enlever la bulle et les tissus environnants de la partie pétreuse de l'os temporal.
- Localisez la conque cochlée en forme (figure 2B) et le séparer du système vestibulaire à l'aide des pinces.
- A ce stade du développement, le labyrinthe osseux n'est pas complètement calcifiée et est facilement disséquée par forceps. Retirez le labyrinthe osseux de la cochlée par une séparation minutieuse à partir de l'extrémité basale et déménagement apicalement l'aide de pinces.
- Le ligament spiral et l'organe de Corti est attachée lové le long de la spirale de la columelle (figure 2C). Retirer délicatement l'organe de Corti en sécurisant le ligament spiral au crochet de la région de la base de l'aide de pinces et dénouement que vous vous déplacez vers l'apex.
- À partir de la base, enlever le ligament spiral de l'organe de Corti en utilisant # 55 pinces fines (figure 2d).
Micro-isolement de l'organe de Corti épithélium sensoriel (facultatif). - Retirez le crochet de l'organe de la région de Corti de la base en utilisant deux seringues à insuline ½ cc avec attaché en permanence U-100 28G ½ aiguilles comme une pince.
- À partir de l'apex, retirez le limbe spirale de la rangée de cellules ciliées internes et procéder basale (figure 2E-F).
Placage l'organe de Corti explant - Retirer la solution poly-L-ornithine/laminin/FBS du puits de culture et d'ajouter 130 ul de milieu de culture.
- Transfert de l'organe de Corti disséqué la lamelle de verre recouvert de la culture et d'orienter ainsi l'explant de sorte que les cils des cellules ciliées sont pointant vers le haut.
- Retirez le support de la culture bien en utilisant une pipette 200 ul. Assurez-vous que la membrane basilaire en contact solide avec la lamelle de verre enduit.
- Ajouter avec précaution 130 uL de milieu de culture à l'organe de Corti à l'aide d'une pipette de 200 ml. Appliquer deux gouttes sur la surface de l'organe de Corti, puis ajouter lentement le volume restant sur le côté de la lamelle. Assurez-vous que l'organe de Corti ne flottent pas dans les milieux de culture, mais elle reste fixée à la lamelle.
- Incuber une nuit à 37 ° C, en présence de 5% de CO 2.
Jour 3. L'électroporation du gène rapporteur dans les organes de culture de Corti.
- Retirez le milieu de culture de l'orgue de la culture Corti.
- Ajouter 130 uL H 2 O pendant 1 min puis retirez à l'aide d'une pipette 200 ul.
- Ajouter 30 uL d'un journaliste DsRed plasmide (2mg / ml H 2 O conservés à -20 ° C).
- Advance les électrodes de l'aide d'un micromanipulateur électroporateur sorte que l'anode unecathodiques e sont de chaque côté de la culture.
- Générer une impulsion (27V, 30 ms, 10 trains d'impulsions) pour électroporer le gène rapporteur dans l'organe de Corti explant culture.
- En option: inverser la polarité de l'impulsion pour assurer l'électroporation du transgène sur les deux côtés et modiolar ligament spiral de l'explant.
- Attendre 5 min.
- Ajouter 130 uL de la Fugene 6: solution d'ADN (3 parties à 2 Fugene ADN parties). Cette solution doit être préparée avant le début de la procédure d'électroporation (étape 20) en utilisant un 3 ml à fond rond en polystyrène de test tube dans une hotte à flux laminaire. Pour rendre cette solution:
- Ajouter 2,4 ul d'Opti-MEM (conservés à 4 ° C) pour le tube à essai.
- Ajouter 0,6 ul de Fugene 6 réactif (conservés à 4 ° C) pour le tube à essai. Assurez-vous d'ajouter le Fugene directement à l'Opti-MEM et éviter le contact direct avec les parois du tube d'essai.
- Vortex pendant 1 seconde.
- Incuber 5 min à température ambiante.
- Ajouter 2,0 uL journaliste DsRed plasmide ADN double brin (conservés à -20 ° C à 100 ug d'ADN / ml de H 2 O aliquotes).
- Vortex pendant 1 seconde.
- Incuber 15 min à température ambiante.
- Ajouter 200 ul de milieu de culture.
- Vortex pendant 1 seconde.
- Incuber une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2.
- Ajouter 2 ml milieu de culture à la culture puits et incuber pendant 37 ° C pendant jusqu'à 10 jours.
Les résultats représentatifs
Nous présentons une méthode pour l'isolement de l'organe de Corti d'une souris périnatale. La procédure peut être utilisée pour les souris aussi jeunes que 16 jours embryonnaire jusqu'à environ 6 jours après la naissance, à quel point le labyrinthe osseux devient suffisamment calcifiés pour rendre la dissection encombrant. Une fois l'organe de Corti est disséqué, il peut être plaqué et cultivés soit dans sa totalité (figure 3) ou que la micro-isolées épithélium sensoriel (figure 4). Nous avons encore présenté une technique pour exprimer des gènes exogènes dans l'organe de Corti cultivés. La culture organotypique est utile pour de nombreux autres types d'études, tels que l'analyse de l'organe d'expression du gène Corti par RT-PCR ou l'hybridation in situ, organe de Corti de co-culture avec des cellules du ganglion spiral ou de cellules souches exogènes utilisant l'isolat de micro- 3, ou l'analyse in vitro de la mort cellulaire des cheveux et de régénération.
Figure 1. Coupe transversale de l'organe de P4 murin de Corti. (A) Une section transversale de la tour basal de la cochlée cryosectioned obtenu à partir d'une souris P4 illustre les structures générales de la cochlée murin décrit dans ce protocole. Les médias Scala est bordée par le ligament spiral et la strie vasculaire latéralement, la membrane de la Reissner s supérieurement, la spirale limbe médial, et la membrane basilaire bas. La boîte indique la région élargie dans B. (B) L'organe de Corti est située sur la face supérieure de la membrane basilaire et comprend une rangée de cellules ciliées internes, trois rangées de cellules ciliées externes, et leurs cellules de soutien. La ligne pointillée 1 indique l'emplacement le long de la membrane basilaire qui est enlevé au cours de la dissection de cet organe Corti. La ligne pointillée 2 indique l'emplacement le long de la membrane basilaire qui est éliminé lors de la procédure de micro-isolement. La couleur verte indique marquage immunohistochimique des calbindine, dont les étiquettes des cellules du limbe interdentaire spirale, les cellules ciliées cochléaires, les neurones du ganglion spiral, ainsi que les cellules du ligament en spirale et vasculaire 7 strie. DAPI étiquetage des noyaux en bleu.
Figure 2. Orgue de dissection Corti. Images de la vidéo qui l'accompagne de l'organe de Corti en évidence une dissection A) le système vestibulaire cochlée et situé dans l'os isolés temporel (rouge), B) le labyrinthe osseux de la cochlée, C), le ligament spiral et attaché organe de Corti après le retrait du labyrinthe osseux, D) la suppression du ligament en spirale et strie vasculaire (rouge) de l'organe de Corti, E) des micro-isolement de l'épithélium sensoriel du limbe spirale (rouge), et F) du isolées spirale limbe (à gauche) et l'épithélium sensoriel (à droite).
Figure 3. L'organe de Corti de culture des explants. DIC images montrant l'organe deCorti sur un P4-Atoh1 nGFP souris qui a été isolé, plaqué, et cultivés pendant cinq jours, comme décrit. Cette souris a été génétiquement modifié afin que les cellules qui expriment le gène de cellules pro-poils homologue Atonal 1 (alias Atoh1 Math1) présentent une protéine fluorescente verte qui est localisée dans le noyau 8. Les organes de Corti de ces souris présentent une étiquette GFP nucléaire dans tous les noyaux des cellules de cheveux et donc permettre une visualisation facile de l'épithélium sensoriel en utilisant un microscope à épifluorescence. La spirale relativement grand limbe peut être vu latéraux à l'épithélium sensoriel. Les cellules mésenchymateuses qui proviennent de l'organe de Corti ont migré loin de l'explant. Blue Label nucléaire est DAPI.
Figure 4. Micro-isolé épithélium sensoriel. Épifluorescence l'image obtenue à partir de l'épithélium sensoriel qui a été isolé à partir d'un P4 organe de Corti murin tel que décrit et mis en culture pendant la nuit. Le micro-isoler a ensuite été fixés dans du paraformaldéhyde 4% et traitées pour immunomarquage de 7a myosine qui étiquettes cellules ciliées cochléaires. Notez l'absence de la spirale comparativement plus limbe de la figure 3. Blue Label nucléaire est DAPI.
Figure 5. Electroporation de gène rapporteur DsRed dans l'organe de Corti cultivés. Organes entiers de Corti de chiots P4 souris Atoh1-nGFP ont été isolés, plaqué, puis électroporation avec le gène rapporteur DsRed tel que décrit et observe ensuite sous un microscope à épifluorescence. Les cellules de l'organe de Corti explant qui ont exprimé la protéine rapporteur DsRed transgéniques présentent une fluorescence rouge des cellules endogènes et de l'exposition épithélium sensoriel une fluorescence verte nucléaire. Cellules transgéniques peuvent être vus tout au long du limbe en spirale et l'épithélium sensoriel.
Discussion
Il ya plusieurs détails qui sont essentiels pour le succès de cette procédure. Plus le temps de l'isolement à l'os temporal organe de Corti d'incubation, plus les chances que les organes se joindre à la lamelle et aboutir à des cultures d'organes viables. Par conséquent, il est important de limiter la quantité de temps entre la dissection et de placer les organes dans l'incubateur. Le choix de l'antibiotique est également crucial, car de nombreux antibiotiques aminoglycosides sont ototoxiques et aboutira à la mort cellulaire des cheveux. Bien qu'il soit préférable de renoncer à l'utilisation des antibiotiques en tout, ce qui laisse ouverte la possibilité de contamination. Par conséquent, nous suggérons l'utilisation de 10 ug / ml d'ampicilline en règle générale à surmonter les problèmes de contamination potentielle.
L'aspect le plus gênant de ce fait, et d'autres procédures pour la culture primaire de l'organe de Corti, est la tendance des organes de flotter hors les plaques pendant l'incubation. Bien que les cultures d'organes flottants peuvent rester viables pendant 5-7 jours, il ya des inconvénients d'organes en culture flottante. Par exemple, des cultures d'organes flottants souvent se replier sur eux-mêmes après 4-5 jours de microscopie rendu problématique. Par la suite, l'intégrité structurale de l'organe peut être compromise par rapport aux organes qui ont été apposés sur la lamelle. Nous avons constaté que les techniques suivantes aident à s'assurer que l'organe de Corti ne flottent pas dans les milieux de culture, mais elle reste fixée à la lamelle. Premièrement, le manteau des lamelles de verre dans l'01:01 polyornithine / laminine complété avec 20% de FBS, comme décrit. La nuit d'incubation appelé dans le présent protocole est le temps minimum que la plaque doit être revêtue. Dans notre laboratoire, nous avons souvent manteau de toutes les plaques que nous avons besoin pour une semaine et les maintenir à 4 ° C jusqu'à ce que le jour avant de l'utiliser quand nous les passer à la pépinière pour une nuit d'incubation. Deuxièmement, après que les organes sont transportés vers les lamelles revêtues, d'orienter l'explant de sorte que les cils des cellules ciliées face. Cette orientation va faciliter l'adhérence de la membrane basilaire de la boîte de culture. Troisièmement, retirez le support dans le puits d'apposer l'explant au plat couché. Cela permettra d'assurer le contact entre la boîte de culture et de la membrane basilaire et de renforcer la capacité des explants d'adhérer au verre. Ce sera également aider à maintenir l'intégrité structurelle des rangées de cellules ciliées. Enfin, soigneusement goutte à goutte 2 gouttes de milieu de culture sur la surface de l'organe de Corti aide d'une pipette capacité de 200 ul et puis, lentement, remplissez le bien par égouttement le volume restant (sur un total 130 pi) sur le côté de la lamelle. Il est important de travailler rapidement pour assurer l'attachement de l'organe de Corti à la lamelle enduit. Depuis le début de la dissection à l'incubation des explants, il faut généralement 10 minutes pour un opérateur pratiqué pour compléter cet organe de Corti procédure d'isolement.
Dans ce protocole, nous présentons également une méthode pour l'isolement des micro-de l'épithélium sensoriel du limbe spirale de l'organe de Corti. Dans cette procédure, le limbe est disséqué en colimaçon loin de l'épithélium sensoriel utilisant 28G ½ aiguilles à insuline comme des outils de dissection. Le composé résultant de micro-isoler des rangées de cellules ciliées et leurs correspondants cellules de soutien (figure 3). L'épithélium sensoriel isolées peuvent ensuite être cultivées comme décrit dans le présent protocole. Cette procédure d'isolement de micro-devrait être comparé à la séparation enzymatique de l'épithélium sensoriel du tissu environnant 4. Chez les mammifères, ainsi que les espèces non-mammifères comme les poulets, la digestion des thermolysine isolée résultats organes vestibulaires de l'isolement des épithéliums sensoriels à partir des cellules mésenchymateuses sous-sol 4. Dans la cochlée de rat, les résultats de digestion thermolysine dans la séparation de la grande crête épithéliale, moins crête épithéliale et accompagne les épithéliums sensoriels de la membrane 5 sous-sol. Cependant, il est difficile de savoir si l'épithélium cochléaire sensorielle peut se rattacher à des plaques revêtues sans les cellules mésenchymateuses accompagnent. Alors que les micro-mécaniques d'isolation méthode et enzymatiques résultat de la méthode de digestion à la séparation de l'épithélium sensoriel du limbe en spirale, des avantages de la dissection micro-isoler au cours de la digestion thermolysine inclure un protocole relativement plus courte, moins cher réactifs, et le stress potentiellement moins de l'explant due aux effets de la digestion enzymatique. En outre, la membrane basale est laissée intacte dans cette démarche, qui peut renforcer l'attachement de l'épithélium sensoriel de la plaque de culture. Les inconvénients de cette méthode comprennent la nécessité de développer les compétences nécessaires pour cette dissection délicate et le potentiel des dommages mécaniques à l'épithélium sensoriel résultant de la dissection micro.
Comme exemple de l'utilité de cette procédure, nous présentons également un exemple de l'utilisation de l'organe deCultures Corti; l'électroporation de gènes exogènes dans la culture des explants. La procédure décrite ci-dessus électroporation est basé sur les méthodes antérieures de l'organe de Corti électroporation. Notamment, Zheng et Gao (2000) décrivent l'électroporation des organes isolés de rat de Corti où les explants sont maintenus en place par électroporation par une rainure moulée d'agarose et ensuite étalées sur revêtues de collagène 8-même glisser LabTek dans un milieu sans sérum 2. Un avantage de leur approche est que les organes sont orientés de telle sorte que les surfaces supérieures des explants face à la cathode, ce qui devrait théoriquement conduire à une répartition homogène de cellules par électroporation dans l'explant. Dans nos mains cependant, la méthode que nous décrivons améliorée sur cette procédure parce que l'organe de Corti est resté fixé à la lamelle pendant toute la procédure réduisant ainsi la manipulation de l'explant après l'électroporation. De plus, un pourcentage plus élevé d'organes de Corti est resté attaché à la lamelle en utilisant cette méthode présentée. Notre méthode est tirée de Jones, et al. (2006) qui utilise l'ajout du réactif Fugene 6 pour augmenter l'efficacité de l'expression des gènes après l'électroporation. Dans le protocole de Jones et al. (2006), les organes sont électroporées, incubé pendant 5 minutes avec 100 uL de réactif de transfection Fugene 6, et 6 plaqués. Notre méthode se distingue dans l'utilisation d'un ratio de 3:2 de Fugene 6 réactifs à l'ADN plasmidique, que nous avons trouvé empiriquement pour offrir un niveau optimal d'expression transgénique avec une toxicité minimale d'orgue. Nous n'utilisons pas non dilué Fugene 6 réactif, ce qui peut entraîner une toxicité pour les cultures. La configuration des électrodes dans notre protocole, ainsi que Jones et al. (2006), les résultats de l'expression génique primaire soit dans la spirale ou limbe épithélium sensoriel selon la position de la cathode. Bien qu'il existe des cellules DsRed positif sur le côté de la culture éloignée de la cathode, il ya une forte concentration de cellules transgéniques plus proche de la cathode. Afin d'assurer une expression complète du transgène dans les deux côtés de l'organe de Corti explant, le courant peut être inversé pour un deuxième train d'impulsions par simple inversion du conduit. Les résultats présentés dans le protocole d'expression du transgène robustes à travers l'organe de Corti (fig. 5).
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Danielle Demêmes et Douglas Cotanche et pour leurs efforts en nous enseignant les méthodes pour l'isolement de l'organe de Corti. En outre, nous tenons à remercier Ismaël Stefanov-Wagner pour l'ingénierie des électrodes électroporateur; Sherry Lin pour son oeuvre d'art contribuent à l'animation vidéo, et Matthew Chana, Jason Howie Meeker, et Kendra Marshall ( www.goodfightproductions.com ) pour produire la vidéo. Ce travail a été financé par des subventions (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-IEMO Core Support d'audience de la recherche) de la NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce |
| 4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% Solution |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | made in mouse |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140-095 | Qualified |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5" |
| #11 Scalpel Blade | BD Biosciences | 372611 | |
| #4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| #55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 10564-011 | High Glucose |
| Horse Serum | Invitrogen | 2605088 | Heat Inactivated |
| Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | Irradiated |
| ½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | BD Biosciences | 329465 | U-100 28G½ |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11-815-091-001 | |
| Polystyrene test tube | Fisher Scientific | 14-956-5A | |
| Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Reporter plasmid | Clontech Laboratories | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 |
| Electroporator | Bio-Rad | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |
References
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