Summary
이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.
Abstract
모든 포유 동물에서 오디션에 대한 감각 상피는 내이 (内耳) (그림 1)의 콘치 모양의 달팽이관 내에있는 Corti의 나선형 기관을 따라 위치하고 있습니다. 청각 시스템의 mechanosensory 세포의 개발 달팽이관,의 세포는 하나 내부 세포의 행 세 (기본 중반 전환)을 네 가지 (혀끝의 차례로) 외부 세포의 행에 정렬됩니다 그 Corti의 기관의 길이에 걸쳐. 세포는 두뇌가 해석할 수있는 신경 자극으로 두개골 기저부의 막의 사운드 유도된 기계적 진동을 transduce. 감각 청각 손실의 대부분은 달팽이 세포의 사망이나 장애로 인해 발생합니다.
청각 연구에 점점 더 필수적인 도구가 고립되고 장기 explant 1,2,9의 체외 문화 인치 일단 격리, explants는 정보에 관한 규범, 변칙, 또는 치료 생리를 제공하기 위해 여러 가지 방법으로 활용 수 있습니다. 유전자 발현, stereocilia의 운동성, 세포 및 분자 생물학뿐만 아니라 머리 세포 재생을위한 생물 학적 접근 Corti의 explants의 기관의 실험 응용 프로그램의 예입니다.
이 프로토콜은 신생아 생쥐에서 Corti의 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 함께 비디오 마우스 새끼에서 측두 골의 격리를 위해 stepwise 방향과 달팽이관, 나선 인대, 그리고 Corti의 기관의 후속 고립을 포함합니다. 일단 고립, 감각 상피는 도금과 전체 체외에서 교양, 또는 추가로 해부 나선 limbus하고 나선 신경절의 뉴런이 부족되는 마이크로 - 분리. 수 있습니다 이 방법을 사용하여 기본 explants은 70~10일에 대한 유지하실 수 있습니다. 이 절차의 유틸리티의 예를 들어, Corti의 explants의 기관은 외인성 DsRed 리포터 유전자로 electroporated 것입니다. 그것은 고립, microdissection, 그리고 Corti의 기관의 주요 문화, 재현성 모호하지 않은, 그리고 stepwise 방향을 제공하기 때문에이 방법은 다른 방법을 통해 출판 향상을 제공합니다.
Protocol
1 일. 살균 및 유리 coverslips의 코팅.
- 압력솥에 유리 현미경 coverslips을 소독 건조.
- 미리 소독 안경 물론 세포 배양 접시의 두 우물에 살균 coverslips를 놓습니다.
- 코트 1:1 폴리 - L - ornithine과 laminin과 coverslips 4에서 하룻밤 20% 태아 소 혈청 (FBS) ° C.와 보충
- 400 μL 폴리 - L - ornithine (4에 저장된 0.01 % 용액 ° C)
- 400 μL laminin (50 μg / -20 ° C에서 aliquots에 저장된 ML 주식 솔루션)
- 200 μL FBS (-20 ° C에서 aliquots에 저장)
- 150 ° C 배양기에서 해부 도구가 하룻밤 사이에 열 소독.
- 10 % 혈청 및 10 MG / ML 암피실린을 포함하는 배지를 확인합니다.
- 90 ML Dulbecco의 수정된 이글 매체
- 5 ML FBS (-20 ° C에서 aliquots에 저장)
- 5 ML 말 혈청 (-20 ° C에서 aliquots에 저장)
- 10 μL 암피실린 (4에 저장된 10 MG / ML 주식 솔루션 ° C)
일 2. Corti의 기관의 분리.
- 긍정적인 흐름 절개 후드를 소독.
- 20 분 대한 자외선 설정
- 70 % 에탄올 모든 표면을 스프레이하고 사용하기 전에 5 분 기다립니다.
- 운영 가위를 사용하여 구멍의 매그넘의 기지에 펍 목을 벨 마우스 (P4).
- 간단히 70 % 에탄올을 포함 10cm 접시에 머리를 씻어.
- 메스 블레이드를 사용하여 표피를 제거합니다.
- 메스 블레이드를 사용하여 화살 봉합 따라 두개골을 열고 다음 forebrain를 이등분하다. 자세한 해부를위한 꼬리 forebrain을 유지합니다.
- 무딘 절개를 사용하여 forebrain, 소뇌와 brainstem를 제거합니다.
- 시간적 뼈 (그림 2A)을 제거 70 % 에탄올에 잠시 그들을 찍어 및 멸균 HBSS를 포함하는 3mm 요리로 전송할 수 있습니다.
- 포셉를 사용하여 측두 골의 바위 부분에서 불라과 주변 조직을 제거합니다.
- 콘치 모양의 달팽이관을 (그림 2B) 찾아 집게를 사용하여 vestibular 시스템에서 그것을 구분합니다.
- 개발이 단계에서, 뼈에 미로 완전히 calcified되지 않고 쉽게 집게를 사용하여 해부합니다. 기초 끝에 시작 집게를 사용하여 apically 이동주의 분리하여 달팽이관의 골질 미로를 제거합니다.
- 나선형 인대 및 Corti의 부착 기관은 modiolus (그림 2C)의 나선 따라 낫게됩니다. 조심스럽게 집게를 사용하여베이스의 후크 지역에서 나선 인대를 확보하고 apically 이동으로 긴장을 풀기에 의해 Corti의 장기를 제거합니다.
- 기지에서 시작, # 55 고급 집게 (그림 2D)를 사용 Corti의 기관에서 나선 인대를 제거합니다.
마이크로 절연 Corti 감각 상피 (옵션)의 기관니다. - 두 사용하여베이스 Corti 훅 지역의 장기를 제거 ½ CC의 인슐린 주사기를 영구적으로 부착 U - 100 28G ½ 집게로 바늘로.
- 꼭대기에서 시작, 내부 세포의 행에서 나선형 limbus를 제거하고 (그림 2E - F) basally 진행합니다.
Corti explant의 오르간을 도금 - 문화의 우물에서 poly-L-ornithine/laminin/FBS 솔루션을 제거하고 배지 130 μl를 추가합니다.
- 잘와 동양 문화의 코팅 유리 coverslip 세포의 속눈썹가 가리키고되도록 explant에 Corti의 해부하는 기관을 전송합니다.
- 물론 200 μL 피펫을 사용하여 문화 매체를 제거합니다. 두개골 기저부의 멤브레인가 코팅된 유리 coverslip와 고체 접촉을하게되었는지 확인합니다.
- 조심스럽게 200 ML의 피펫을 사용하여 Corti의 기관에 배지 130 μL를 추가합니다. Corti의 장기의 표면에 두 방울을 적용하고 서서히 coverslip 측면에 나머지 볼륨을 추가합니다. Corti의 기관이 coverslip에 부착된 남아있는 문화 미디어 부동하지만,하지 않는지 확인하십시오.
- 37 5 % CO 2의 존재에 ° C에서 밤새 품어.
3 일. Corti의 교양 기관에 리포터 유전자의 Electroporation.
- Corti 문화의 기관에서 배지를 제거합니다.
- 1 분 130 μL H 2 O를 추가하고 다음 200 μL 피펫을 사용하여 제거합니다.
- 플라스미드 DsRed 기자 (-20 ° C에 저장된 2mg / ML H 2 O) 30 μL를 추가합니다.
- 있도록 micromanipulator를 사용하여 electroporator의 전극을 양극 사전차 음극은 문화의 양쪽에있다.
- Corti explant 문화의 기관에 기자의 유전자를 electroporate하는 펄스를 (27V, 30 MS 기간, 10 펄스 트레인) 생성.
- 옵션 : modiolar과 explant의 나선 인대의 양쪽에 transgene의 electroporation을 위해 펄스의 극성을 반대로.
- 5 분 기다립니다.
- DNA 용액 (2 부품 DNA 3 부품 Fugene) Fugene 6 130 μL를 추가합니다. 이 솔루션은 이전 층류 후드에 3 ML 라운드 바텀 폴리스티렌 테스트 튜브를 사용하여 electroporation 절차의 시작 (단계 20) 준비를해야합니다. 이 솔루션을 만들려면 :
- 테스트 튜브에 Opti - 멤 (4 ° C에 저장된)의 2.4 μL를 추가합니다.
- 테스트 튜브에 Fugene 6 시약의 0.6 μL (4 ° C에 보관)을 추가합니다. Opti - 멤에 직접 Fugene을 추가하고 테스트 튜브의 측면과 직접적인 접촉을 피하기 위해 있는지 확인하십시오.
- 일초에 대한 와동.
- 실온에서 5 분 알을 품다.
- 2.0 μL DsRed 기자 플라스미드 DNA를 두 번 좌초 (100 μg의 DNA / ML H 2 O의 aliquots에서 -20 ° C에 보관)을 추가합니다.
- 일초에 대한 와동.
- 실온에서 15 분 알을 품다.
- 문화 매체 200 μL를 추가합니다.
- 일초에 대한 와동.
- ° C 5 % CO 2에서 37 밤새 품어.
- 잘 문화 2 ML 문화 매체를 추가하고 37 ° C에 대해 10 일 최대 품어.
대표 결과
우리는 perinatal 마우스 Corti의 기관의 분리를위한 방법을 제시한다. 절차는 뼈에 미로가 충분히 절개가 성가신 렌더링 calcified되고있는 시점에서, 출생 후의 일에 대해 최대 16 일 배아처럼 젊은 쥐 6 사용할 수 있습니다. Corti의 장기를 해부되면, 그것은 하나의 전체 (그림 3)이나 마이크로 절연 감각 상피 (그림 4)로 도금과 교양 수 있습니다. 우리는 더 Corti의 교양 기관에서 외인성 유전자를 표현하는 기술을 제시했습니다. organotypic 문화는 RT - PCR이나 원위치 하이브리드화에서 마이크로 분리를 사용하여 나선 신경절 세포 또는 외인성 줄기 세포와 함께 Corti 공동 문화의 기관을 사용하여 Corti 유전자 표현의 기관의 분석과 같은 연구의 많은 다른 유형을 위해 유용합니다 3 또는 머리 세포 죽음과 재생의 체외 분석 인치
그림 1. Corti의 P4 murine 기관의 크로스 섹션을 참조하십시오. (A) P4 마우스에서 얻은 cryosectioned 달팽이관의 기초 설정에서 단면이 프로토콜에 설명된 murine 달팽이관의 일반적인 구조를 보여줍니다. 스칼라 미디어가 옆으로 vascularis 나선 인대와 선에 의해 경계이며, Reissner S 멤브레인 위에, 나선형 limbus medially, 그리고 inferiorly 두개골 기저부의 막. 상자 B에 확장 영역이 (B) Corti의 기관은 두개골 기저부의 막의 우수한 측면에 위치하고 있으며 내부 세포, 외부 세포의 세 행, 그리고 각각 지원하는 세포 중 하나 행을 포함 지적했다. 점선 1 Corti의 해부의 기관 중에 제거되는 두개골 기저부의 멤브레인 따라 위치를 나타냅니다. 점선 2 마이크로 절연 절차 중에 제거되는 두개골 기저부의 멤브레인 따라 위치를 나타냅니다. 녹색 나선형 limbus의 치간 세포, 달팽이 세포, 나선 신경절의 뉴런뿐만 아니라 나선 인대 7 vascularis 선의 세포를 라벨 calbindin의 immunohistochemical 레이블을 나타냅니다. 핵의 DAPI 라벨은 파란색입니다.
그림 2. Corti의 해부 하이라이트의 기관의 동반 비디오에서 Corti의 해부의 기관. 이미지) 격리 측두 골의 (적색) 이내에있는 달팽이관과 vestibular 시스템, B) 달팽이관의 골질 미로, C) 나선 인대와 연결을 뼈다귀 미로, D의 제거 후 Corti의 기관) 나선형 인대의 제거 및 선 vascularis (적색) Corti, E의 기관에서) 나선 limbus (적색)에서 감각 상피의 미세 분리하고, F) 격리 나선형 limbus (왼쪽)와 감각 상피 (오른쪽).
그림 3. 의 장기를 보여주는 Corti explant의 교양 기관. DIC 이미지설명한대로 5 일간, 절연 도금 및 교양 P4 Atoh1 - nGFP 마우스의 Corti. 프로 헤어 세포 유전자에게 무조의 상동체 1 (Atoh1 일명 Math1)를 표현 세포 핵 8화된되는 녹색 형광 단백질을 전시 있도록이 마우스는 유전자 조작되었습니다. 이 생쥐에서 Corti의 기관은 모든 머리 세포 핵에서 핵 GFP 레이블을 전시하므로 epifluorescent 현미경을 사용하여 감각 상피 쉽게 시각화를위한 수 있습니다. 비교적 큰 소용돌이 limbus는 감각 상피로 측면을 볼 수 있습니다. Corti의 기관에서 유래했습니다 Mesenchymal 세포는 explant 떨어져 마이 그 레이션했습니다. 블루 핵 레이블은 DAPI입니다.
그림 4. 마이크로 절연 감각 상피. 설명 및 야간 교양 등 Corti의 P4 murine 기관으로부터 격리되어 감각 상피에서 얻은 Epifluorescent 이미지. 마이크로 분리는 다음 4 % paraformaldehyde에 고정하고 달팽이 세포를 라벨 마이 오신의 7A의 immunolabeling에 대한 처리되었습니다. 그림 3에서 비교적 큰 소용돌이 limbus의 부재를 적어 둡니다. 블루 핵 레이블은 DAPI입니다.
그림 5. Corti의 교양 기관에 DsRed 리포터 유전자의 Electroporation. P4 Atoh1 - nGFP 마우스 새끼에서 Corti의 전체 장기가 고립되었습니다, 도금 후 epifluorescent 현미경으로 설명하고 볼로 DsRed 리포터 유전자로 electroporated. 유전자 변형 DsRed 기자 단백질을 표현 Corti의 explant의 기관의 세포는 감각 상피 전시 녹색 형광 핵의 붉은 형광과 내생 세포를 나타냅니다. 형질 세포는 나선형 limbus과 감각 상피를 통해 볼 수 있습니다.
Discussion
이 절차의 성공을 위해 중요한 몇 가지 세부 사항이 있습니다. 측두 골의 절연에서 Corti 보육, 장기 이식 문화의 coverslip 및 결과에 연결할 수있는 큰 기회의 기관에 짧은 시간. 따라서, 해부 및 보육에 장기 배치 사이의 시간의 양을 제한하는 것이 중요합니다. 많은 aminoglycoside의 항생제가 ototoxic하고 헤어 세포 죽음을 초래하기 때문에 항생제의 선택도 중요합니다. 그것이 모두 항생제의 사용을 ...없이 지내다 것이 바람직하지만, 이것은 오염에 대한 가능성을 엽니다 떠납니다. 따라서, 우리는 잠재적인 오염 문제를 극복하기 위해 일반적으로 10 μg / ML 암피실린의 사용을 권장합니다.
이 대부분의 성가신 측면, 그리고 Corti의 기관의 기본 문화에 대한 다른 절차가 부화하는 동안 접시를 부동으로 장기 경향이있다. 부동 장기 문화가 5~7일 결혼은 남아있을 수 있지만, culturing 부동 장기의 단점이있다. 예를 들어, 현미경은 문제가 렌더링 4-5일 후 자신에 자주 배 부동 기관 문화. coverslip에 부착된되었습니다 장기에 비해 이후, 장기의 구조적 무결성이 손상 될 수 있습니다. 우리는 다음과 같은 기술이 Corti의 기관은 문화 미디어 부동하지 않도록하는 데 도움이 발견했지만 coverslip에 부착된 남아 있습니다. 첫째, 1시 1분 polyornithine / laminin에 코팅 유리 coverslips는 설명 20% FBS와 함께 보충. 이 프로토콜에 대한라고 하룻밤 배양은 접시를 코팅해야한다는 최소한의 시간입니다. 저희 연구실에서는, 우리는 종종 우리는 코트 1 주일에 필요한 4에서 그들을 유지하는 것이 접시의 모든 ° 우리가 하룻밤 배양을위한 인큐베이터로 이동할 때 C는 날까지 전에 사용할 수 있습니다. 세포의 속눈썹가 얼굴 있도록 둘째, 장기 방향은, 코팅 coverslips에 explant를 이송 후. 이 오리 엔테이션은 문화 접시에 두개골 기저부의 막의 부착을 용이하게합니다. 셋째, explant의 코팅 접시에 부착하기 위해 잘 내에서 미디어를 제거합니다. 이것은 문화 요리와 두개골 기저부의 멤브레인 사이의 접촉을 보장하고 유리에 준수하는 explants의 능력을 향상시킬 것입니다. 이것은 세포의 행 구조적 무결성을 유지하는 도움이 될 것입니다. 마지막으로, 신중하게 200 μL 용량 피펫을 사용하여 Corti의 장기의 표면에 배지 2 방울 드립 후 서서히 coverslip의 측면에 남아있는 볼륨 (총 130 μL의) 흘리지하여 잘 입력합니다. 코팅 coverslip에 Corti의 기관의 첨부 파일을 보장하기 위해 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. explants의 부화에 절개의 개시에서 그것은 일반적으로 Corti 격리 절차의 기관을 완료하려면 연습 운영자 10 분 걸립니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 Corti의 기관의 나선 limbus에서 감각 상피의 마이크로 - 절연을위한 방법을 제시한다. 이 절차에서는 나선 limbus는 28G를 사용하여 감각 상피에서 떨어진 해부 있습니다 ½ 인슐린 바늘 해부 도구로. 마이크로 분리를 발생하는 세포 및 해당 지원하는 세포 (그림 3)의 행으로 구성되어 있습니다. 이 프로토콜에서 설명한대로 격리 감각 상피 그때 교양 수 있습니다. 이 마이크로 절연 절차는 조직 4 주변에서 감각 상피 조직의 효소 분리에 비해해야합니다. 예 닭, 지하 mesenchymal 세포 4 감각 상피 조직의 격리 격리된 vestibular 장기 결과의 thermolysin 소화 등 포유류에서뿐만 아니라 비 포유 동물 종. 쥐 달팽이관에서 큰 상피 능선의 분리, 낮은 상피 리지와 지하 막 5 동반 감각 상피 조직의 thermolysin의 소화 결과. 그러나, 그것은 달팽이 감각 상피가 함께 mesenchymal 세포없이 코팅 접시에 첨부할 수 있는지 확실하지 않다. 기계적 마이크로 절연 방식과 나선 limbus에서 감각 상피 조직의 분리 효소 소화 방법 결과, thermolysin의 소화를 통해 마이크로 분리 절개의 장점을 모두 비교적 짧은 프로토콜, 저렴 시약, 그리고 잠재적으로 덜 스트레스를 포함하는 동안 소화 효소의 효과로 인해 explant. 또한, 지하 막는 문화 판에 감각 상피의 첨부 파일을 향상시킬 수있는,이 접근법에 그대로 남아 있습니다. 이 방법의 단점이 섬세한 해부와 마이크로 절개로 인한 감각 상피 잠재적인 기계적 손상에 대한 기술을 개발 할 필요가 있습니다.
이 절차의 유틸리티의 예를 들어, 우리는 또한 기관의 사용 중 한 예를 제시Corti 문화, explant 문화에 외인성 유전자의 electroporation. 위에서 설명한 electroporation 절차는 Corti의 electroporation의 기관의 이전 방법에 따라 달라집니다. 특히, 청 그리고 가오 (2000)은 explants는 아가로 오스의 성형 홈으로 electroporation을 위해 장소에서 개최하고 콜라겐에 대한 혈청이없는 배지 2 코팅 8 잘 LabTek 슬라이드 도금 아르 Corti의 절연 쥐 기관의 electroporation을 설명합니다. 그들의 접근 방식의 장점은 장기가 explants의 상단 표면 이론적 explant 전체 electroporated 세포도 분포가 발생해야하는 음극을 얼굴 있도록 방향이다. Corti의 기관이이를 electroporation 후 explant의 조작을 줄이는 절차 전반에 걸쳐 coverslip에 부착된 남아 있기 때문에 우리의 손에 그러나 우리가 설명하는 방법은이 절차를 개선. 또한, Corti의 장기의 높은 비율이 제시 방법을 사용하여 coverslips에 붙어 있었다. 우리의 방법은 존스, 외. (2006) electroporation 후 유전자 발현의 효율성을 높일 수있는 Fugene 6 시약의 추가를 사용하여에서 가져옵니다. 존스 외. (2006) 프로토콜에서는, 장기는 100 Fugene 6 transfection 시약의 μL, 그리고 도금 6 5 분 incubated, electroporated 있습니다. 우리의 방법은 우리가 최소한의 장기 독성과 최적의 형질 표현을 제공하기 위해 경험적으로 발견 플라스미드 DNA에 Fugene 6 시약의 3시 2분 비율의 사용 다릅니다. 우리는 문화에 독성을 초래할 수있는, undiluted Fugene 6 시약을 사용하지 마십시오. 우리 프로토콜에서 전극 구성뿐만 아니라 나선 limbus 또는 음극의 위치에 따라 감각 상피 중의 기본 유전자 발현의 존스 외. (2006) 결과. 음극에 먼 문화의 측면에 DsRed 긍정적인 세포가 있지만, 가까이 음극으로 유전자 변형 세포의 높은 농도가있다. Corti explant의 기관의 양쪽에있는 transgene의 완전한 표현을 보장하기 위해, 현재 단순히 반전 연결에 의해 두 번째 펄스 열차 되돌릴 수 있습니다. Corti (그림 5)의 장기에 걸쳐 transgene의 강력한 표현의 표시 프로토콜 결과입니다.
Acknowledgments
저자 Demêmes 다니엘과 더글러스 Cotanche 감사의 마음을 우리에게 Corti의 기관의 격리를 위해 방법을 가르치는 그들의 노력에 대한 것입니다. 비디오 애니메이션 그녀의 공헌 아트웍을 셰리 린,, 그리고 마 차나, 제이슨 메커 및 켄드라 마샬 (또한, 우리는 electroporator 전극 공학 Stefanov - 바그너 이스마엘에게 감사를 표합니다 www.goodfightproductions.com ) 동영상을 제작. NIDCD에서이 작품은 보조금 (연구 청문회 P30DC05209 - MEEI 코어 지원,, RO1DC007174 첨단 R03DC010065 - 파커)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce |
| 4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% Solution |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | made in mouse |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140-095 | Qualified |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5" |
| #11 Scalpel Blade | BD Biosciences | 372611 | |
| #4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| #55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 10564-011 | High Glucose |
| Horse Serum | Invitrogen | 2605088 | Heat Inactivated |
| Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | Irradiated |
| ½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | BD Biosciences | 329465 | U-100 28G½ |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11-815-091-001 | |
| Polystyrene test tube | Fisher Scientific | 14-956-5A | |
| Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Reporter plasmid | Clontech Laboratories | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 |
| Electroporator | Bio-Rad | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |
References
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