Summary
Este procedimento descreve um método para o isolamento e cultura do órgão murino de Corti com ou sem o limbo espiral e neurônios do gânglio espiral. Nós também demonstrar um método para a expressão de um gene exógeno repórter no órgão de Corti explante por eletroporação.
Abstract
Em todos os mamíferos, o epitélio sensorial para a audição está localizado junto ao órgão espiral de Corti que reside dentro da cóclea em forma de concha do ouvido interno (fig. 1). Células ciliadas da cóclea em desenvolvimento, que são as células mecanosensorial do sistema auditivo, estão alinhados em uma fileira de células ciliadas internas e três (na base e médio gira) a quatro (no giro apical) fileiras de células ciliadas externas que medem o comprimento do órgão de Corti. Células ciliadas transdução de som induzida por vibrações mecânicas da membrana basilar em impulsos neurais que o cérebro pode interpretar. A maioria dos casos de perda auditiva neurossensorial é causada por morte ou disfunção das células ciliadas da cóclea.
Uma ferramenta cada vez mais essencial na pesquisa auditivo é o isolamento e cultivo in vitro do explante órgão 1,2,9. Uma vez isolados, os explantes podem ser utilizados de várias maneiras para fornecer informações sobre a normativa, anômalos, ou fisiologia terapêutico. Expressão gênica, motilidade estereocílios das células e biologia molecular, bem como abordagens biológicas para a regeneração das células ciliadas são exemplos de aplicações experimentais do órgão de Corti explantes.
Este protocolo descreve um método para o isolamento e cultura do órgão de Corti de ratos recém-nascidos. O vídeo que acompanha inclui instruções passo a passo para o isolamento do osso temporal de filhotes de rato, e posterior isolamento da cóclea, ligamento espiral, e órgão de Corti. Uma vez isolado, o epitélio sensorial pode ser folheado e cultivadas in vitro em sua totalidade, ou como mais um micro-dissecados isolar que falta a do limbo espiral e neurônios do gânglio espiral. Usando este método, explantes primários pode ser mantida por 7-10 dias. Como um exemplo da utilidade deste procedimento, o órgão de Corti explantes será electroporated com um gene repórter exógenos DsRed. Este método proporciona uma melhoria em relação a outros métodos publicados, pois fornece direções reprodutível, sem ambiguidades, e passo a passo para o isolamento, microdissecção e cultura primária do órgão de Corti.
Protocol
Dia 1. Esterilização e revestimento de lamínulas de vidro.
- Seca esterilizar lamínulas de vidro para microscópio em autoclave.
- Coloque o lamínulas esterilizadas em dois poços de uma pré-esterilizados placa de cultura de células de quatro bem.
- Brasão com as lamelas 01:01 poli-L-ornitina e laminina suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) durante a noite a 4 ° C.
- 400 mL poli-L-ornitina (solução de 0,01% armazenadas a 4 ° C)
- 400 laminina mL (50 mg / mL solução estoque armazenado em alíquotas a -20 ° C)
- FBS 200 mL (armazenada em alíquotas a -20 ° C)
- Heat-esterilizar as ferramentas de dissecção durante a noite em um 150 ° C incubadora.
- Tornar o meio de cultura contendo soro de 10% e 10 mg / mL ampicilina.
- Modificado em 90 mL Dulbecco Eagle Medium
- 5 mL FBS (armazenada em alíquotas a -20 ° C)
- 5 mL soro de cavalo (armazenada em alíquotas a -20 ° C)
- 10 mL ampicilina (10 mg / mL solução estoque armazenado a 4 ° C)
Dia 2. Isolamento do órgão de Corti.
- Esterilizar o capô dissecção positiva de fluxo.
- ligar a luz UV por 20 min
- spray de todas as superfícies com álcool 70% e esperar 5 min antes do uso.
- Decapitar filhote de rato (P4) na base do forame usando uma tesoura operacional.
- Brevemente lavar a cabeça em 10 centímetros prato contendo etanol 70%.
- Retirar a epiderme usando uma lâmina de bisturi.
- Abrir o crânio ao longo da sutura sagital utilizando uma lâmina de bisturi e depois bisect parte frontal do cérebro. Manter o cérebro anterior caudal para dissecção ainda mais.
- Remover o prosencéfalo, cerebelo e tronco cerebral usando dissecção romba.
- Retire os ossos temporais (fig. 2A), mergulhá-los brevemente em etanol 70%, e transferi-los para um prato de 3 milímetros contendo HBSS estéril.
- Utilizando uma pinça, remova a bula e no tecido circundante a partir da porção petrosa do osso temporal.
- Localize a cóclea em forma de concha (fig. 2B) e separá-lo do sistema vestibular com a pinça.
- Nesta fase de desenvolvimento, o labirinto ósseo não está completamente calcificada e é facilmente dissecados usando uma pinça. Remover o labirinto ósseo da cóclea pela separação cuidado a partir do final basal e movendo-se no plano apical de fórceps.
- O ligamento espiral e de órgãos ligados de Corti é enrolada ao longo da espiral do modíolo (fig. 2C). Remova cuidadosamente o órgão de Corti, protegendo o ligamento espiral na região gancho da base usando uma pinça e descontrair-lo como você se move apicalmente.
- Começando na base, remover o ligamento espiral a partir do órgão de Corti usando uma pinça fina # 55 (fig. 2D).
Micro-isolamento do órgão de Corti epitélio sensorial (Opcional). - Remover o órgão de Corti região gancho da base com duas seringas de insulina ½ cc com permanentemente ligado U-100 28G ½ agulhas como fórceps.
- Começando no ápice, remova o do limbo espiral da fileira de células ciliadas internas e proceder basally (fig. 2E-F).
Chapeamento o órgão de Corti explante - Remover a solução poly-L-ornithine/laminin/FBS dos poços cultura e adicionar 130 mL de meio de cultura.
- Transferir o órgão de Corti dissecados para a lamela de vidro revestido na cultura bem e orientar o explante, para que os cílios das células ciliadas estão apontando para cima.
- Remova a mídia na cultura bem com uma pipeta de 200 mL. Certifique-se que a membrana basilar faz com que o contato contínuo com as lamelas de vidro revestido.
- Juntar cuidadosamente 130 mL de meio de cultura para o órgão de Corti usando uma pipeta 200 mL. Aplicar duas gotas sobre a superfície do órgão de Corti e, em seguida, adicionar lentamente o volume restante para o lado da lamela. Certifique-se que o órgão de Corti não flutuam no meio de cultura, mas permanece afixada à lamela.
- Incubar durante a 37 ° C na presença de 5% de CO 2.
Dia 3. Eletroporação do gene repórter em órgão de cultura de Corti.
- Remova o meio de cultura do órgão de cultura Corti.
- Adicionar 130 mL H 2 O, durante 1 minuto e depois retire com uma pipeta de 200 mL.
- Adicionar 30 mL de repórter DsRed plasmídeo (2 mg / mL H 2 O armazenadas a -20 ° C).
- Avançar os eletrodos do electroporator usando um micromanipulador de modo que o anodo umcatódicos são nd de ambos os lados da cultura.
- Gerar um pulso (27V, 30 ms de duração, 10 trens de pulso) para electroporate o gene repórter para o órgão de Corti cultura explante.
- Opcional: inverter a polaridade do pulso para garantir a eletroporação do transgene em ambos os lados e modiolar o ligamento espiral do explante.
- Aguarde 5 min.
- Adicionar 130 mL da Fugene 6: DNA solução (3 a 2 partes Fugene DNA partes). Esta solução deve ser preparada antes do início do procedimento de eletroporação (passo 20) usando um 3 mL de fundo redondo tubo de ensaio de poliestireno em uma capela de fluxo laminar. Para tornar esta solução:
- Adicionar 2,4 mL de Opti-MEM (armazenado a 4 ° C) para o tubo de ensaio.
- Adicionar 0,6 mL de reagente Fugene 6 (armazenadas a 4 ° C) para o tubo de ensaio. Certifique-se de adicionar o Fugene diretamente para o Opti-MEM e evitar o contato direto com os lados do tubo de ensaio.
- Vortex durante 1 segundo.
- Incubar 5 minutos à temperatura ambiente.
- Adicionar 2,0 mL DsRed repórter do DNA plasmídeo encalhado (armazenadas a -20 ° C a 100 DNA mcg / mL H 2 O alíquotas).
- Vortex durante 1 segundo.
- Incubar 15 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 200 mL de meio de cultura.
- Vortex durante 1 segundo.
- Incubar durante a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Adicione 2 mL de meio de cultura a cultura bem e incubar 37 ° C por até 10 dias.
Resultados representante
Nós apresentamos um método para o isolamento do órgão de Corti de um camundongo perinatal. O procedimento pode ser usado para ratos jovens como dia embrionário 16 até cerca de seis dias pós-parto, altura em que o labirinto ósseo se torna suficientemente calcificadas para tornar a dissecção pesado. Uma vez que o órgão de Corti é dissecado, pode ser folheado e cultivadas tanto em sua totalidade (fig. 3) ou como micro-isolado epitélio sensorial (fig. 4). Temos ainda apresentada uma técnica para expressar genes exógenos no órgão de Corti cultivadas. A cultura organotípicas é útil para muitos outros tipos de estudo, tais como a análise do órgão de Corti de expressão gênica utilizando RT-PCR ou hibridização in situ, órgão de Corti co-cultura com células ganglionares espiral ou células-tronco exógenas utilizando a isolar micro- 3, ou análise in vitro de morte celular e regeneração do cabelo.
Figura 1. Seção transversal do órgão P4 murino de Corti. (A) A seção transversal da espira basal da cóclea um cryosectioned obtido a partir de um rato P4 ilustra as estruturas gerais da cóclea murino descrito neste protocolo. A mídia scala faz fronteira com o ligamento espiral e estria vascular lateralmente, a membrana de Reissner s superiormente, a espiral limbo medialmente, ea membrana basilar inferiormente. A caixa indicada a região expandida em B. (B) O órgão de Corti está localizado no lado superior da membrana basilar e inclui uma linha de células ciliadas internas, três fileiras de células ciliadas externas, e suas respectivas células de suporte. Uma linha tracejada indica a localização ao longo da membrana basilar que é removido durante este órgão de dissecção Corti. A linha tracejada 2 indica a localização ao longo da membrana basilar que é removida durante o processo de micro-isolamento. Verde indica imunohistoquímica de calbindina, que rotula as células interdentais do limbo espiral, células ciliadas da cóclea, os neurônios do gânglio espiral, assim como células do ligamento espiral e estria vascular 7. DAPI rotulagem dos núcleos é em azul.
Figura 2. Órgão de Corti dissecção. Imagens do vídeo que acompanha do órgão de Corti destacar dissecção A) o sistema de cóclea e vestibular localizado dentro do osso temporais isolados (vermelho), B) do labirinto ósseo da cóclea, C) o ligamento espiral e anexado órgão de Corti após a remoção do labirinto ósseo, D) a remoção do ligamento espiral e estria vascular (vermelho) do órgão de Corti, E) micro-isolamento do epitélio sensorial do limbo espiral (vermelho) e F), o isolado do limbo espiral (esquerda) e epitélio sensorial (direita).
Figura 3. Órgão de Corti cultivadas explante imagem. DIC mostrando o órgão deCorti de um rato P4 Atoh1-nGFP que foi isolado, chapeado, e cultivadas por cinco dias, conforme descrito. Este rato tem sido geneticamente modificados para que as células que expressam o gene de células pró-cabelo homólogo atonal 1 (aka Atoh1 Math1) exibem uma proteína verde fluorescente que está localizado ao núcleo 8. Os órgãos de Corti destes ratos exibem uma etiqueta GFP nuclear em todos os núcleos das células ciliadas e, portanto, permitir a fácil visualização do epitélio sensorial usando um microscópio de epifluorescência. A relativamente grande do limbo espiral pode ser vista lateral ao epitélio sensorial. Células mesenquimais, que se originaram do órgão de Corti migraram longe do explante. Rótulo azul é nuclear DAPI.
Figura 4. Micro-isolado epitélio sensorial. Epifluorescência imagem obtida a partir do epitélio sensorial que foi isolado de um órgão P4 murino de Corti como descritas e cultivadas durante a noite. O micro-isolado foi então fixado em paraformaldeído 4% e processados para imunomarcação de Miosina 7 rótulos que as células ciliadas da cóclea. Observe a ausência da comparativamente maior do limbo espiral a partir da figura 3. Rótulo azul é nuclear DAPI.
Figura 5. Eletroporação de gene repórter DsRed no órgão de Corti cultivadas. Órgãos inteiros de Corti de filhotes P4 Atoh1-nGFP rato foram isolados, banhados, e depois electroporated com o gene repórter DsRed como descrito e, em seguida, visto sob um microscópio de epifluorescência. Células do órgão de Corti explante que expressa a proteína transgênica repórter DsRed células exibem uma fluorescência vermelha e endógenos da exposição epitélio sensorial uma fluorescência verde nuclear. Células transgénicas pode ser visto em todo o limbo espiral e epitélio sensorial.
Discussion
Há vários detalhes que são fundamentais para o sucesso deste procedimento. Quanto menor o tempo de isolamento de osso temporal para órgão de Corti de incubação, maior a chance de que os órgãos vão anexar ao lamela e resultar em culturas de órgãos viáveis. Portanto, é importante para limitar a quantidade de tempo entre a dissecção e colocando os órgãos na incubadora. A escolha do antibiótico é também crucial, já que muitos antibióticos aminoglicosídeos são ototóxicos e irá resultar na morte das células ciliadas. Embora seja preferível a abandonar o uso de antibióticos por completo, o que deixa em aberto a possibilidade de contaminação. Portanto, sugerimos o uso de 10 mcg / mL ampicilina como regra geral para superar problemas de contaminação em potencial.
O aspecto mais problemático deste, e outros procedimentos para a cultura principal do órgão de Corti, é a tendência dos órgãos de flutuar fora as placas durante a incubação. Embora a cultura de órgãos flutuante podem permanecer viáveis por 5-7 dias, há desvantagens de órgãos de cultura flutuante. Por exemplo, culturas de órgãos, muitas vezes flutuante vezes sobre si mesmas após 4-5 dias renderização microscopia problemática. Posteriormente, a integridade estrutural do órgão podem ser comprometidas quando comparados com os órgãos que têm sido colocadas à lamela. Nós descobrimos que as técnicas a seguir ajudam a garantir que o órgão de Corti não flutuam no meio de cultura, mas permanece afixada à lamela. Primeiro, lamínulas revestimento do vidro em 01:01 polyornithine / laminina suplementado com 20% FBS como descrito. A incubação overnight chamado no presente protocolo é o tempo mínimo que a placa deve ser revestido. Em nosso laboratório, que muitas vezes casaco de todas as chapas que precisamos para uma semana e mantê-los a 4 ° C até o dia antes de usar quando movê-las para a incubadora por um período de incubação durante a noite. Em segundo lugar, depois de os órgãos são transportados para as lamelas revestido, orientar o explante, para que os cílios das células ciliadas face para cima. Esta orientação irá facilitar a aderência da membrana basilar para a placa de cultura. Em terceiro lugar, remova a mídia dentro do poço para apor o explante ao prato revestido. Isto irá assegurar o contacto entre o prato de cultura e da membrana basilar e melhorar a capacidade dos explantes para aderir ao vidro. Isso também irá ajudar na manutenção da integridade estrutural das fileiras de células ciliadas. Por fim, com cuidado de gotejamento de 2 gotas de meio de cultura na superfície do órgão de Corti usando uma pipeta 200 mL de capacidade e então lentamente preencher o bem por gotejamento o volume restante (130 mL do total) no lado da lamela. É importante trabalhar com rapidez para assegurar a fixação do órgão de Corti à lamela revestido. Desde o início da dissecção para a incubação dos explantes, que normalmente demora 10 minutos para um operador praticados para completar este órgão de Corti procedimento de isolamento.
Neste protocolo, apresentamos também um método para o isolamento micro-sensorial do epitélio do limbo espiral do órgão de Corti. Neste procedimento, o limbo espiral é dissecada longe do epitélio sensorial usando 28G ½ agulhas de insulina como ferramentas de dissecção. O composto resultante micro-isolar as linhas de células ciliadas e seus correspondentes células de suporte (fig. 3). O epitélio sensorial isolada pode então ser cultivadas conforme descrito neste protocolo. Este procedimento de isolamento micro-deve ser comparado com a separação enzimática do epitélio sensorial do tecido circundante 4. Nos mamíferos, bem como não-mamíferos, tais como galinhas, digestão thermolysin de resultados isolados vestibular órgãos no isolamento do epitélio sensorial a partir de células mesenquimais cave 4. No rato cóclea, os resultados da digestão thermolysin na separação da maior cordilheira epiteliais, menor cume epitelial e epitélio sensorial que acompanha a partir da membrana basal 5. No entanto, não está claro se o epitélio sensorial da cóclea pode anexar às placas revestidas sem as células mesenquimais que acompanham. Embora ambos o método de isolamento de micro-mecânica e digestão enzimática resultado do método na separação do epitélio sensorial do limbo espiral, as vantagens da dissecção de micro-isolar mais a digestão thermolysin incluem um protocolo relativamente curto, reagentes mais baratos, e potencialmente menos estresse para o explante, devido aos efeitos enzimáticos da digestão. Além disso, a membrana basal permanece intacta nesta abordagem, o que pode aumentar a fixação do epitélio sensorial para a placa de cultura. Desvantagens deste método incluem a necessidade de desenvolver as habilidades para esta dissecção delicada e dano mecânico em potencial para o epitélio sensorial resultante da dissecção micro.
Como um exemplo da utilidade deste procedimento, apresentamos também um exemplo do uso do órgão deCorti culturas, a eletroporação de genes exógenos na cultura explante. O procedimento de eletroporação descrito acima é baseado em métodos anteriores do órgão de Corti eletroporação. Nomeadamente, Zheng e Gao (2000) descrevem o eletroporação de órgãos isolados de ratos de Corti, onde os explantes são mantidos no lugar de eletroporação por um sulco moldado de agarose e, em seguida, semeadas em colágeno revestido de 8 poços deslize LabTek no soro livre de meio 2. Uma vantagem de sua abordagem é que os órgãos são orientadas de modo que as superfícies superiores dos explantes enfrentar o cátodo, que teoricamente deveria resultar em uma distribuição uniforme de células electroporated em todo o explante. Em nossas mãos no entanto, o método que descrevemos melhor sobre este procedimento, pois o órgão de Corti permaneceu afixada na lamela durante todo o procedimento, reduzindo a manipulação do explante após a eletroporação. Além disso, uma percentagem mais elevada dos órgãos de Corti permaneceu ligado à lamínulas usando este método apresentado. Nosso método é retirado de Jones, et al. (2006) que utiliza a adição do reagente 6 Fugene para aumentar a eficiência da expressão do gene após a eletroporação. No protocolo de Jones et al. (2006), os órgãos são electroporated, incubadas por 5 minutos com 100 mL de reagente de transfecção Fugene 6, e 6 banhado. Nosso método é diferente do uso de uma proporção de 3:2 do reagente Fugene 6 a DNA plasmídeo, que encontramos empiricamente para fornecer expressão transgênica ideal com toxicidade nos órgãos mínimo. Nós não usamos não diluído Fugene 6 reagente, que pode resultar em toxicidade às culturas. A configuração do eletrodo em nosso protocolo, bem como Jones et al. (2006), resulta na expressão do gene principal tanto no limbo espiral ou epitélio sensorial, dependendo da posição do cátodo. Embora existam DsRed células positivas no lado da cultura distante para o catodo, há uma maior concentração de células transgênicas mais perto do cátodo. Para garantir uma completa expressão do transgene em ambos os lados do órgão de Corti explante, a corrente pode ser revertida para um trem de pulsos segundo, simplesmente invertendo as ligações. O protocolo apresentado resultados na expressão robusta do transgene em todo o órgão de Corti (fig. 5).
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Demêmes Danielle e Douglas Cotanche e por seus esforços em nos ensinar os métodos para o isolamento do órgão de Corti. Além disso, gostaríamos de agradecer Ismael Stefanov-Wagner para a engenharia dos eletrodos electroporator; Sherry Lin por sua arte contribuindo para a animação de vídeo, e Matthew Chana, Jason Meeker, e Kendra Marshall ( www.goodfightproductions.com ) para a produção do vídeo. Este trabalho foi financiado por subvenções (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI Suporte Básicos para Audição de Investigação) da NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce |
| 4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% Solution |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | made in mouse |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140-095 | Qualified |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5" |
| #11 Scalpel Blade | BD Biosciences | 372611 | |
| #4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| #55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 10564-011 | High Glucose |
| Horse Serum | Invitrogen | 2605088 | Heat Inactivated |
| Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | Irradiated |
| ½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | BD Biosciences | 329465 | U-100 28G½ |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11-815-091-001 | |
| Polystyrene test tube | Fisher Scientific | 14-956-5A | |
| Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Reporter plasmid | Clontech Laboratories | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 |
| Electroporator | Bio-Rad | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |
References
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