Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

Summary

Denna procedur beskriver en metod för isolering och odling av murina organ Corti med eller utan spiral limbus och spiral nervceller ganglion. Vi visar också en metod för uttrycket av en exogen reporter gen i det organ i Corti Explantation av elektroporation.

Abstract

I alla däggdjur, är den sensoriska epitelet för audition längs spiral organ Corti som finns inom conch formade snäckan i innerörat (fig 1). Hårceller i u-snäckan, som är de mechanosensory cellerna i hörselsystemet, justeras på en rad av inre hårceller och tre (i bas och mid-varv) till fyra (i den apikala tur) rader av yttre hårceller som spänner över längden på organ Corti. Hårcellerna transduce ljud-inducerad mekaniska vibrationer i basilarmembranet i neurala impulser som hjärnan kan tolka. De flesta fall av sensorineural hörselnedsättning orsakas av dödsfall eller dysfunktion i cochlea hårceller.

Ett allt viktigare verktyg i hörsel forskning är den isolering och in vitro-kultur av orgeln Explantation ^1,2,9. När isolerade, kan explants utnyttjas på flera sätt att ge information om normativt, avvikande eller terapeutiska fysiologi. Genuttryck, sinneshår motilitet, cell-och molekylärbiologi, samt biologiska metoder för håret cellförnyelsen är exempel på experimentella tillämpningar av organ Corti explants.

Detta protokoll beskriver en metod för isolering och odling av organ för Corti från nyfödda möss. Den medföljande videon innehåller stegvisa anvisningar för isolering av tinningbenet från mus ungar, och efterföljande isolering av snäckan, spiralen ligament och organ Corti. När isolerade, kan den sensoriska epitelet beläggas och odlas in vitro i sin helhet, eller som en ytterligare dissekeras mikro-isolera som saknar spiralen limbus och spiral nervceller ganglion. Med denna metod kan primära explants upprätthållas i 7-10 dagar. Som ett exempel på nyttan av detta förfarande kommer organ Corti explants vara electroporated med en exogen DsRed reporter genen. Denna metod ger en förbättring jämfört med andra publicerade metoder för att det ger reproducerbara, entydiga och stegvis anvisningar för isolering, microdissection, och primära kultur organ Corti.

Protocol

Dag 1. Sterilisering och beläggning av glas täckglas.

1. Torr sterilisera täckglas glas mikroskop i en autoklav.
2. Placera steriliserade täckglas i två brunnar i en pre-steriliserade fyra-och cellodling maträtt.
3. Täck täckglas med 01:01 poly-L-Ornithine och laminin kompletteras med 20% fetalt bovint serum (FBS) över natten vid 4 ° C.
   1. 400 mikroliter poly-L-Ornithine (0,01% lösning förvaras vid 4 ° C)
   2. 400 mikroliter laminin (50 mikrogram / ml stamlösning förvaras i alikvoter vid -20 ° C)
   3. 200 mikroliter FBS (lagrad i alikvoter vid -20 ° C)
4. Värme-sterilisera dissekering verktyg över natten i en 150 ° C inkubator.
5. Gör odlingsmedium innehållande 10% serum och 10 mg / ml ampicillin.
   1. 90 mL Dulbecco ändrade Eagle Medium
   2. 5 ml FBS (lagrad i alikvoter vid -20 ° C)
   3. 5 ml hästserum (lagrad i alikvoter vid -20 ° C)
   4. 10 mikroliter ampicillin (10 mg / ml stamlösning förvaras vid 4 ° C)

Dag 2. Isolering av organ Corti.

1. Sterilisera det positiva huven flödet dissekering.
   1. slå på UV-ljus i 20 minuter
   2. spraya alla ytor med 70% etanol och vänta 5 minuter före användning.
2. Halshugga mus valp (P4) vid basen av foramen magnum med operativsystem sax.
3. Kortfattat skölja huvudet i 10 cm skål som innehåller 70% etanol.
4. Ta bort överhuden med skalpell blad.
5. Öppna kraniet längs sagittala suturen med skalpell blad och sedan HALVERA framhjärnan. Behåll caudal framhjärnan för ytterligare dissektion.
6. Ta bort framhjärnan, lillhjärnan och hjärnstammen med dissektion.
7. Ta bort den temporala ben (fig. 2A), doppa dem helt kort i 70% etanol, och överföra dem till en 3 mm maträtt innehållande steril HBSS.
8. Använd pincett, ta bort bulla och omgivande vävnad från STENAKTIG delen av tidsmässiga ben.
9. Leta reda på conch formade snäckan (fig. 2B) och skilja den från det vestibulära systemet med hjälp av pincett.
10. I detta skede av utvecklingen, är den beniga labyrinten inte helt förkalkad och är lätt att dissekeras med pincett. Ta bort den beniga labyrint hörselsnäckan genom noggrann separation början i basala slutet och flytta apikalt med pincett.
11. Spiralen ligament och bifogade organ Corti är lindad längs spiralen av modiolus (fig. 2C). Ta försiktigt bort organ Corti genom att säkra den spiral ligament på kroken regionen basen med hjälp av pincett och koppla den när du flyttar apikalt.
12. Börjar på basen, ta bort spiralen ligament från organ Corti med # 55 fin pincett (fig. 2D).
    Micro-isolering av organ Corti sensoriska epitelet (tillval).
13. Ta bort organ Corti krok region i botten med två ½ Sprutor cc insulin med fast ansluten U-100 28G ½ nålar som pincett.
14. Börja i toppen, ta bort spiralen limbus från den rad av inre hårceller och fortsätt basally (fig 2E-F).
    Plätering av organ Corti Explantation
15. Ta bort poly-L-ornithine/laminin/FBS lösning från den kultur brunnarna och tillsätt 130 l odlingsmedium.
16. Överför dissekerade organ Corti på belagt glas täckglas i kulturen väl och rikta Explantation så att flimmerhåren i hårcellerna pekar uppåt.
17. Ta bort mediet i kulturen väl med en 200 mikroliter pipett. Se till att basilarmembranet gör solid kontakt med belagt glas täckglas.
18. Tillsätt försiktigt 130 mikroliter odlingsmedium till organ Corti med hjälp av en 200 ml pipett. Applicera två droppar på ytan av de organ Corti och därefter långsamt resterande volym till sidan av täckglas. Se till att organ Corti inte flyta i kulturmedia kvar men sitter på täckglas.
19. Inkubera över natten vid 37 ° C i närvaro av 5% CO _2.

Dag 3. Elektroporation av reporter genen i odlade organ Corti.

1. Ta bort odlingsmedium från organ Corti kultur.
2. Tillsätt 130 mikroliter H ₂ O under 1 minut och ta sedan bort med hjälp av en 200 mikroliter pipett.
3. Tillsätt 30 mikroliter av DsRed reporter plasmid (2 mg / ml H ₂ O förvaras vid -20 ° C).
4. Advance elektroderna av electroporator med en mikromanipulator så att anoden ennd katod finns på båda sidor av kulturen.
5. Generera en puls (27V, 30 ms varaktighet, 10 pulståg) till electroporate reportern gen i organ Corti Explantation kultur.
   1. Tillval: omvänd polaritet pulsen att säkerställa elektroporering av transgenen på både modiolar och spiral sidor ligament i Explantation.
6. Vänta 5 min.
7. Tillsätt 130 mikroliter av Fugene 6: DNA-lösning (3 delar Fugene till 2 delar DNA). Denna lösning bör vara beredda innan starten av elektroporation förfarande (steg 20) med en 3 ml rund botten rör polystyren test i ett laminärt flöde huva. För att göra denna lösning:
   1. Tillsätt 2,4 mikroliter av Opti-MEM (lagras vid 4 ° C) till provröret.
   2. Tillsätt 0,6 mikroliter av Fugene 6 reagens (lagras vid 4 ° C) till provröret. Se till att lägga till Fugene direkt till Opti-MEM och undvik direkt kontakt med sidorna av provröret.
   3. Vortex i 1 sekund.
   4. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
   5. Tillsätt 2,0 mikroliter DsRed reporter plasmid dubbelsträngat DNA (förvaras vid -20 ° C vid 100 mikrogram DNA / ml H ₂ O portioner).
   6. Vortex i 1 sekund.
   7. Inkubera 15 minuter vid rumstemperatur.
   8. Tillsätt 200 mikroliter odlingsmedium.
   9. Vortex i 1 sekund.
8. Inkubera över natten vid 37 ° C i 5% CO _2.
9. Tillsätt 2 medelstora mL kultur till kultur väl och inkubera i 37 ° C i upp till 10 dagar.

Representativa resultat

Vi presenterar en metod för isolering av organ Corti från en perinatal mus. Förfarandet kan användas för möss så unga som embryonala dag 16 upp till ca postnatal dag 6, vid vilket tillfälle beniga labyrinten tillräckligt blir förkalkade att göra dissekering besvärligt. När organ Corti dissekeras, kan det vara pläterade och odlade antingen i sin helhet (fig 3) eller som mikro-isolerade sensoriska epitelet (fig 4). Vi har vidare lagt fram en teknik för att uttrycka exogena gener i odlade organ Corti. Den organotypic kulturen är användbart för många andra typer av studier, såsom analys av organ Corti genuttryck med hjälp av RT-PCR eller in situ hybridisering, organ Corti co-kultur med celler spiral ganglion eller exogena stamceller med hjälp av mikro-isolera ^3, eller in vitro-analys av hår celldöd och förnyelse.

Figur 1. Tvärsnitt av P4 murina organ Corti. (A) Ett tvärsnitt från basala årsskiftet en cryosectioned snäckan från en P4 mus illustrerar det allmänna strukturer murina hörselsnäckan som beskrivs i detta protokoll. Scala media gränsar spiralen ligament och stria vascularis sidled, det Reissner s membranet fint, spiralen limbus medialt och basilarmembranet inferiorly. Lådan visade regionen expanderat i B. (B) organ Corti ligger på den överlägsna sidan av basilarmembranet och innehåller en rad av inre hårceller, tre rader av yttre hårceller, och deras respektive stödjande celler. Streckad linje 1 anger läge längs basilarmembranet som avlägsnas under denna organ Corti dissekering. Streckad linje 2 visar läge längs basilarmembranet som avlägsnas vid mikro-isolering förfarande. Grönt betyder immunhistokemiska märkning av calbindin, vilka etiketter interdentala celler i spiral limbus, Cochlear celler hår, spiral nervceller ganglion, liksom cellerna i spiral ligament och stria vascularis ^7. DAPI märkning av kärnor är i blått.

Figur 2. Organ Corti dissekering. Bilder från den medföljande video av organ Corti dissektion markera A) snäckan och vestibulära systemet ligger i den isolerade tinningbenet (röd), b) de beniga labyrint av snäckan, C) spiralen ligament och bifogas organ Corti efter avlägsnande av beniga labyrint, D) avlägsnande av spiralen ligament och stria vascularis (röd) från organ Corti, E) mikro-isolering av sensoriska epitelet från spiralen limbus (röd), och F) isolerad spiral limbus (vänster) och sensoriska epitelet (höger).

Figur 3. Odlade organ Corti Explantation. DIC bild som visar organCorti av en P4 Atoh1-nGFP mus som var isolerad, pläterade, och odlade i fem dagar enligt. Denna mus är genetiskt modifierade så att celler som uttrycker den pro-håret cell genen atonal homolog 1 (Atoh1 aka Math1) uppvisar ett grönt fluorescerande protein som är lokaliserad till kärnan ^8. Det organ Corti från dessa möss uppvisar en nukleär GFP etikett i allt hår cellkärnor och därmed möjliggör enkel visualisering av sensoriska epitelet med hjälp av en epifluorescent mikroskop. Den relativt stora spiral limbus kan ses i sidled till den sensoriska epitelet. Mesenkymala celler som har sitt ursprung från organ Corti har migrerat från Explantation. Blå kärnkraft etikett DAPI.

Figur 4. Micro-isolerade sensoriska epitelet. Epifluorescent bild från de sensoriska epitelet som har isolerats från en P4 murin organ Corti som beskrivs och odlade natten. Mikro-isolat var då som fastställs i 4% paraformaldehyd och behandlas för immunolabeling av myosin 7a vilka etiketter cochlea hårceller. Notera avsaknaden av jämförelsevis större spiral limbus från figur 3. Blå kärnkraft etikett DAPI.

Figur 5. Elektroporation av DsRed reporter genen i de odlade organ Corti. Whole organ Corti från P4 Atoh1-nGFP mus valpar isolerades, pläterade, och sedan electroporated med DsRed reporter genen som beskrivs och sedan ses under en epifluorescent mikroskop. Celler i organ Corti Explantation som uttryckte de transgena DsRed reportern protein uppvisar en röd fluorescens och endogena celler i sensoriska epitelet uppvisar en grön nukleär fluorescens. Transgena celler kan ses i hela spiralen limbus och sensoriska epitelet.

Discussion

Det finns flera detaljer som är kritiska för att lyckas med detta förfarande. Ju kortare tid från tinningbenet isolering till organ Corti inkubation, desto större chans att organen kommer att lägga till täckglas och resultera i livskraftiga orgel kulturer. Därför är det viktigt att begränsa den tid mellan dissektion och placera organ i inkubatorn. Valet av antibiotika är också avgörande, eftersom många aminoglykosid antibiotika är ototoxiska och kommer att resultera i håret celldöd. Även om det är bättre att avstå från användningen av antibiotika helt lämnar denna öppna möjligheten för kontamination. Därför föreslår vi användning av 10 mikrogram / ml ampicillin som regel att övervinna eventuella föroreningar problem.

Den mest besvärande aspekt av detta, och andra förfaranden för den primära kultur organ Corti, är tendensen hos de organ flyta bort plattorna under inkubationstiden. Även om flytande orgel kulturer kan vara lönsamt för 5-7 dagar, det finns nackdelar med odling flytande organ. Till exempel flytande orgel kulturer ofta lägger på sig själv efter 4-5 dagar rendering mikroskopi problematisk. Därefter kan den strukturella integriteten av orgeln blir äventyras jämfört med organ som har fästs på täckglas. Vi har funnit att följande tekniker bidra till att de organ Corti inte flyta i kultur media, men är fortfarande fäst på täckglas. Först päls glaset täckglas i 1:1 polyornithine / laminin kompletteras med 20% FBS som beskrivs. Den natten inkubation krävs i detta protokoll är den minsta tid att plattan ska vara belagda. I vårt laboratorium, vi ofta päls alla de plattor som vi behöver i en vecka och hålla dem vid 4 ° C tills dagen före att använda när vi flyttar dem till drivhus för en övernattning inkubation. Andra plats, efter de organ transporteras till belagda täckglasen, den Explantation orientera så att flimmerhåren av hårcellerna uppåt. Denna inriktning kommer att underlätta anslutning av basilarmembranet till kulturen skålen. Tredje, ta bort materialet inom väl att anbringa explantation till belagda skålen. Detta kommer att säkerställa kontakt mellan kulturen skålen och basilarmembranet och öka möjligheten för explants att hålla fast vid glaset. Detta kommer också att bidra till att upprätthålla den strukturella integriteten i rader av hårcellerna. Slutligen försiktigt droppa 2 droppar odlingsmedium på ytan av de organ Corti med hjälp av en 200 mikroliter kapacitet pipett och sedan långsamt fylla bra genom att droppa den återstående volymen (av totalt 130 mikroliter) på sidan av täckglas. Det är viktigt att arbeta snabbt för att försäkra att fästa organ Corti till belagda täckglas. Från inledandet av dissekering till inkubering av explants tar det normalt 10 minuter för en van operatör att slutföra detta organ Corti isolering förfarande.

I detta protokoll presenterar vi också en metod för mikro-isolering av sensoriska epitelet från spiral limbus av organ Corti. Vid detta förfarande är spiral limbus dissekerade bort från sensoriska epitelet med hjälp av 28G ½ insulin nålar som dissekering verktyg. Den mikroorganism som isolerar består av rader av hårcellerna och deras motsvarande stödjande celler (bild 3). De isolerade sensoriska epitelet kan sedan odlas som beskrivs i detta protokoll. Denna mikro-isolering förfarande bör jämföras med den enzymatiska separation av sensoriska epitel från omgivande vävnad ^4. Hos däggdjur, samt icke-däggdjur såsom kycklingar, thermolysin rötning av isolerade vestibulära organ leder till isolering av sensoriska epitel från källaren mesenkymala celler ^4. Hos råtta snäckan, thermolysin matsmältning leder till separation av de större epiteliala åsen, mindre epiteliala ås och medföljande sensoriska epitel från basalmembranet ^5. Det är dock oklart om cochlea sensoriska epitelet kan fästa på plåt utan medföljande mesenkymala celler. Medan både den mekaniska mikro-isolering metod och enzymatisk digestionsmetoden leda till separation av de sensoriska epitel från spiralen limbus, fördelarna med mikro-isolera dissektion över thermolysin matsmältningen inkluderar en relativt kortare protokoll, billigare reagens och potentiellt mindre stress den Explantation grund av enzymatiska effekter av matsmältningen. Dessutom är basalmembranet kvar intakt i denna strategi, som kan öka fastsättning av sensoriska epitelet till kulturen plattan. Nackdelar med denna metod är bland annat behovet av att utveckla kompetens för denna känsliga dissektion och potentiella mekaniska skador på sensoriska epitelet till följd av mikro dissekering.

Som ett exempel på nyttan av detta förfarande, presenterar vi också ett exempel på användning av organCorti kulturer, den elektroporering av exogena gener i Explantation kulturen. Det elektroporation förfarande som beskrivs ovan är baserad på tidigare metoder för organ Corti elektroporation. Särskilt Zheng och Gao (2000) beskriver elektroporering av isolerade råtta organ Corti där explants hålls på plats för elektroporering av en gjuten spåret agaros och sedan pläterade på kollagen bestruket 8-brunnars LabTek bild i serumfritt medelstora ^2. En fördel med deras metod är att de organ är orienterade så att den övre ytorna på explants ansiktet katoden, vilket teoretiskt sett bör resultera i en jämn fördelning av electroporated celler inom hela Explantation. I våra händer dock den metod som vi beskriver förbättrats på detta förfarande eftersom det organ Corti återstod fäst på täckglas under hela förfarandet därigenom minska manipulation av Explantation efter elektroporation. Dessutom återstod en högre andel av organ Corti knutna till täckglas med denna presenteras metoden. Vår metod är hämtad från Jones, et al. (2006) som använder tillägget av Fugene 6 reagens för att öka effektiviteten av genuttryck efter elektroporation. I Jones et al. (2006) protokoll, är de organ electroporated, ruvade i 5 minuter med 100 mikroliter av Fugene 6 transfektion reagens, och pläterade ^6. Vår metod skiljer sig i användandet av en 3:2 förhållande Fugene 6 reagens plasmid-DNA, som vi funnit empiriskt för att ge optimal transgena uttrycket med minimal organtoxicitet. Vi använder inte outspädd Fugene 6 reagens, vilket kan resultera i toxicitet för de kulturer. Den elektrod konfiguration i våra protokoll, samt Jones et al. (2006), resulterar i primära genuttryck i antingen spiral limbus eller sensoriska epitelet beroende på position katod. Även om det finns DsRed positiva celler på sidan av den kultur fjärran till katoden, det finns en högre koncentration av transgena celler närmare katoden. För att säkerställa ett fullständigt uttryck för transgenen på båda sidor av organ Corti Explantation, kan den nuvarande vändas för en andra pulståg genom att helt enkelt vända leder. De presenterade protokollet ger robust uttryck för transgenen hela organ Corti (fig 5).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass microscope coverslips	DYNALAB Corporation	2010	10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce
4 ringed cell culture dish	Greiner Bio-One	627170	Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	0.01% Solution
Laminin	BD Biosciences	354232	made in mouse
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140-095	Qualified
Operating scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6806	Straight, sharp-blunt length 5"
#11 Scalpel Blade	BD Biosciences	372611
#4 Dumoxel forceps	Fine Science Tools	11241-30
#55 Dumostar fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Invitrogen	10564-011	High Glucose
Horse Serum	Invitrogen	2605088	Heat Inactivated
Ampicillin Sodium Salt	Invitrogen	11593-027	Irradiated
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe	BD Biosciences	329465	U-100 28G½
Fugene 6 Transfection Reagent	Roche Group	11-815-091-001
Polystyrene test tube	Fisher Scientific	14-956-5A
Laminar flow hood	The Baker Company (Stanford, ME)	Model SG603a	SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Invitrogen	31985
Reporter plasmid	Clontech Laboratories	632539	pCMV DsRed-Express 2
Electroporator	Bio-Rad	165–2662	BioRad Gene Pulser Xcell