Summary
유전자 Inducible의 운명 매핑 (GIFM) 마크와 훌륭한 공간과 시간적 제어 트랙 세포
Abstract
운명의지도 progenitors가 개발 및 성인 조직에서 특정 구조 및 세포 유형에 기여하는 방법을 결정하는 생체내의 세포를 표시 및 추적에 의해 생성됩니다. 이런 개념에서 사전에 내가 유전자 혈통에 따라 운명이지도를 만드는, F는 유전자 발현, 세포의 운명, 그리고 생체내 세포의 동작을 연결, M apping (GIFM)를 먹은 nducible G enetic입니다.
GIFM 이용 X - 크리어 라인 여기서 X는 수정된 박테리오 파지 단백질, Cre 호텔 recombinase (크리어 T)의 공간적 표현을 수여 유전자 규제 요소 유전자 또는 집합입니다. 크리어 T는 크리어 T를 렌더링으로 수정된 전자 strogen R eceptor의 리간드 바인딩 도메인을 포함하고 약물 tamoxifen의 부재에있는 세포질에서 분리된. loxP 사이트 둘러싸인 DNA 시퀀스 사이의 핵 및 mediates의 재조합에 translocates tamoxifen 출시 크리어 T의 결합. loxP 그런 GFP로 기자의 유전자를 앞에 카세트를 중지 어귀 사이 GIFM에서 재조합 일반적으로 발생합니다.
마우스는 어느 지역 또는 셀 타입 특정 크리어 및 조건부 기자 allele을 포함, 훈련하고 있습니다. 기자의 중지 카세트의 리포터 유전자의 추가 전송을 방지하기 때문에 치료 생쥐가 표시가 없습니다. 우리는 크리어 T 릴리스와 기자의 중지 카세트를 제거 핵에 후속 translocation의 시간적 제어를 제공 초과 - 임신 여성에 경구 gavage으로 tamoxifen을 관리할 수 있습니다. 재조합 다음, 기자의 allele은 constitutively하고 heritably 표시됩니다. 사건의이 시리즈는 자신의 유전자의 역사가 기록됩니다 indelibly 그러한 세포를 표시합니다. recombined 기자는 따라서, 한번에, 처음 크리어의 T를 운전하는 데 사용되는 유전자 발현의 uncoupled는 높은 충실도 유전자 혈통의 추적 역할을합니다.
우리는 성인 세포 유형과 조직에 유전 lineages의 정상적인 발전과 확인할 기여를 공부하기 위해 마우스 GIFM를 적용합니다. 우리는 또한 더 나은 인간의 유전 질환의 돌출 기능을 모방 복잡한 phenotypes을 이해하는 돌연변이 유전자 배경에 세포를 따라 GIFM 사용합니다.
실험 방법을 통해이 동영상이 문서에서는 가이드 연구자를 성공적으로 GIFM을 적용합니다. 우리는 잘 특징 Wnt1 - 크리어 T를 사용하는 방법을 보여줍니다; E12.5에서 절개 및 epifluorescence stereomicroscopy에 의해 분석하여 다음 구두 gavage 통해 배아 일 (E) 8.5에서 tamoxifen을 투여하여 mGFP 마우스. 우리는 또한 explant 준비 또는 외과 분석을위한 운명 매핑된 도메인을 마이크로 해부하다 및 전체 마운트 형광 이미징을위한 성인 운명 매핑 두뇌를 해부하다하는 방법을 보여줍니다. 총체적으로,이 절차는 연구자가 발달 생물학과 질병 모델에서 중요한 질문을 해결하실 수 있습니다.
Protocol
Tamoxifen의 준비 및 구내 Gavage 절차 (E8.5)
- 사전 예열 옥수수 기름에 tamoxifen을 해소하여 tamoxifen의 20 MG / ML 재고 솔루션을 준비합니다.
- 37 솔루션을 품어 ° C nutator과 간헐적으로 소용돌이로 2 시간.
- 4 광 저장 ° C에서 tamoxifen 주식을 보호하고, 1 개월 최대 사용합니다.
- 그리고 유전자 특정 크리어 T의 allele과 기자 allele 모두를 나르는 남자, 운명 매핑 실험 들어, 스위스 웹스터 여성 (타코닉에서 구입한 wildtype)로 구성된 번식 쌍을 설정합니다. mGFP 남성 (엘리서 2009), 데모를 위해, 우리는 Wnt1 - 크리어 T를 사용하고 있습니다.
- 질 플러그의 모양을 위해 매일 아침 스위스 웹스터 여자를 확인합니다. 질 플러그가 0.5 일 이후의 성교로 여겨지고있다 오늘의 아침 (0900)을 지정하고이 시작점을 기준으로 tamoxifen 관리의 날짜를 계산합니다. (이 실험을 위해, 배아 일 8.5이 사용되었습니다).
- tamoxifen 주식 솔루션 (4 MG tamoxifen) 200 μl를 그리는 동물 먹이 바늘 (20G X 1-1/2)로 1 ML의 주사기를 사용합니다.
- 단단히 목의 목덜미를 쥐고하여 시간 임신 스위스 웹스터 여자를 구속하고 다시 머리를 고정하고 복부 측면가 직면되도록 뒤집.
- 직선에 몸을 유지하는 무료 손가락 사이의 꼬리를 잡아.
- 입 구석에 먹이를 바늘을 넣고 부드럽게 입안의 지붕을 따라 바늘을 안내입니다.
- 그것은 몸에 평행이되도록 동시에 틸팅 헤드가 다시 똑바로 목을 유지하는 동안 바늘을 회전합니다.
- 위쪽으로, 식도 아래 바늘을 안내입니다. 기관을 입력하지 않도록주의하십시오. 바늘, 동물의 개그 반응 종사하거나, 마우스 투쟁 경우, 즉시 바늘을 제거하고 다시 gavage을 시도에 대한 저항이있다면.
- 먹이를 바늘이 위 속에되면, 위장으로 tamoxifen을 관리하고 해부의 날짜까지 그녀의 홈 케이지에 암컷을 반환합니다.
Craniotomy :
- Intracardially 성인 운명 4% PFA와 마우스를 매핑 perfuse하고 그냥 어깨 위에있는 척추를 절단하여 가위로 머리를 제거합니다.
- 두피를 잘라 스컬을 폭로하기 위해 머리 (꼬리에 주동이의)의 지느러미 정중선을 따라 메스를 실행합니다.
- 메스를 사용하여 두개골의 측면과 함께 후부에서 초과 조직 또는 근육 멀리 다쳤어요.
- 포셉, 찔린 단지 후각 구근에 주동이의 훌륭한 가위의 조언을 수용하기 위해 작은 구멍을 만들 정중선에서 두개골과 함께.
- 이 구멍에 좋은 가위를 삽입하고 후각 구근의 측면 약 길이로 절개가 중간합니다. 이 상처가 비골과 정면 뼈의 교차로에서 두개골을 휴식하고 가위 좋은 액세스를 제공합니다.
- 기본 조직의 손상을 방지하기 위해 멀리 두뇌에서 직각 가위 도움말을 계속해야하는 두개골 (지느러미 정중선)에서 화살 봉합을 따라 잘라.
- 부드럽게 머리를 노출하는 중간 절개 함께 뼈를 집게와 떨어져 껍질 두개골을 파악. 두개골은 작은 조각으로 떨어져 칩 또는 더 큰 섹션에 와해 수 있습니다. 이마, 정수리, interparietal 및 후두 뼈를 모두 제거하는 포셉를 사용하여 계속합니다.
- 양쪽에있는 구면 뼈를 곤란하여 paraflocculi을 (소뇌의 수준에있는 두뇌의 측면 가장자리를 따라 위치) 표시할 수 뼈를 균열. 부드럽게 뼈를 멀리 당기십시오.
- 거꾸로 머리를 턴 (지느러미 쪽 아래)와 두개골 신경을 끊을 수 있고 두개골에서 뇌를 공개 포셉을 사용합니다.
전체 마운트 현미경 : 성인 브레인
- 형광 해부 범위를 사용하여 GFP 마킹에 대해 성인용 머리를 평가합니다.
- PBS 및 PictureFrame 또는 기타 적절한 소프트웨어를 사용하여 사진을 포함하는 페트리 접시에 머리를 전송합니다.
전체 마운트 현미경 : E12.5 태아
- 형광 해부 범위를 사용하여 GFP 마킹에 대한 전체 마운트 배아를 평가합니다.
- PBS 및 PictureFrame 또는 기타 적절한 소프트웨어를 사용하여 사진을 포함하는 페트리 접시에 전체 장착하여 긍정적인 GFP하는 이들을 전송합니다.
- 각각의 배아에서 꼬리의 작은 조각을 공략하기 집게를 사용하여 PCR 튜브의 각 조각을 배치하고 유전자형 전체 마운트 분석을 통해 본 결과를 확인하기 위해 두 대립 유전자에 대한 PCR을 (엘리서 2009)를 사용하여 조직을.
마이크로 해부와 E12.5 태아의 복부 mesencephalon의 explant 준비
- 자궁 체인 및 ID의 절개를 다음전체 마운트 형광, 세포 배양 접시에 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 전송 배아의 운명을 매핑 배아의 entification.
- 좋은 가위를 사용하여 rhombomere 1 꼬리 transversely 절단 배아의 머리 부분을 제거합니다.
- 다음, diencephalon 통해 코로나 잘린 머리의 주동이의 부분을 제거합니다. 이것은 튜브와 같은 구조하는 mesencephalic 소포 양식 지느러미와 복부 조직 사이의 통로를 통해 4 뇌실. 노출됩니다
- 조심스럽게 가위 도움말 완벽하게 "오픈 도서"준비를 생성, 튜브를 열고, 주동이의에 꼬리 지느러미 정중선을 따라 4 뇌실, 그리고, 싹둑,에 넣습니다. mesencephalon의 두 지느러미 반쪽이 옆으로있는 반면 복부 mesencephalon은 지금, medially 노출됩니다.
- 더 단호하다로 조직하기 위해서는 복부 mesencephalon 밑에 남아있는 이외의 신경 조직을 제거합니다. 필요하다면, explant의 지느러미 "날개"는뿐만 아니라 평면하다 것이라는 등 주동이의와 꼬리 부분에 노치합니다. explant 이제 "등의 mesencephalon의 날개를 상징하는 나비, 그리고 rhombomere 1 꼬리 유사합니다.
- 자세한 외과 분석이나 세포 배양 실험에 대한 복부 mesencephalon를 분리하려면, 조직의 측면 (지느러미 부분)를 제거합니다.
대표 결과 :
이 GIFM 실험에서 Wnt1 - 표현 전지는 영구적이며 heritably E8.5에서 Wnt1 - CreERT으로 tamoxifen을 투여하여 embryogenesis 동안 표시, mGFP의 배아가. 그 후이 표시된 전지는 전지 개발에 걸쳐 신경 구조에 기여하는 방법 Wnt1 파생 결정하기 위해 전체 마운트 형광 및 섹션 immunohistochemistry를 통해 시각입니다. 전체 마운트 형광은 mGFP 기자의 멤브레인 바운드 GFP 구성 요소에 의존하므로 셀룰러 정보뿐만 아니라 Wnt1 - 파생 신경 예측의 overarching 볼 수 있습니다. 예를 들어, 주로 midbrain, 사후 hindbrain 및 척수 (그림 1A)에 E12.5 전시 GFP의 형광에 E8.5, Wnt1 - CreERTmGFP의 배아에서 tamoxifen 관리와 함께. 높은 배율에서 고급의 연결을 전망은 midbrain, 신체 벽, 사지, 그리고 craniofacial 지역 innervating 볼 수 있습니다. 이 발달 단계에서 배아는 반투명이고 내부 GFP 라벨은 쉽게 분별이다. 그러나, 두뇌 개발과 같은, 성숙한 조직의 밀도는 내부 뇌 구조에서 냄새가 나는데 GFP의 형광을 가린다. 따라서, E8.5에서 tamoxifen 관리와 함께, 오직 사소한 GFP 라벨이 전체 마운트 형광 (그림 1C, 삽입된 페이지)로 성인의 우수한 colliculi에서 관찰됩니다. 또한, 일부 axonal 전망은 (표시되지) hindbrain의 복부 표면에 따라 자, 이제 볼 수 있습니다. 대조적으로, tamoxifen이 E9.5에 투여되었을 때, 실질적인 GFP 라벨은 전체 열등한 colliculi (그림 1B, 삽입된 페이지)에 걸쳐 발생합니다. 전체 마운트 형광이 증가 나타낼 수 Wnt1 - 표현 E9.5에서 세포 등의 midbrain의 표면 지역에 더 크게 기여하거나 E8.5에서 Wnt1 표현 세포보다이 지역 내에서 많은 프로세스를 확장합니다. 에 관계없이 전체 마운트 형광이 차이는 개발하는 동안 Wnt1 표현의 동적 특성을 반영하고 GIFM가 성숙한 성인으로 배아에서 뚜렷한 세포 인구를 수행하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
Wnt1 - CreERT에서 immunohistochemistry, 운명 매핑 조직 섹션, mGFP 동물은 세포 수준에서 분석하고 있습니다. GFP 및 β - galactosidase (β - 여자)에 대한 항체가 신경 세포 구조와 유형에 Wnt1 혈통의 벌금 규모 세포 기여를 결정하는 조직을 특정 생체 다양한와 함께 사용됩니다. E12.5에서 E8.5에서 tamoxifen의 관리 및 조직 분석, 이중 긍정적인 세포 (GFP +와 β - 여자 +)가 복부 midbrain (그림 1B)를 통해 자, 이제 계획과 midbrain과 hindbrain 전반에 걸쳐 관찰하고 있습니다. 성인 두뇌에서 E8.5에 표시된 Wnt1 - 일족이 뛰어난 및 하부 colliculi뿐만 아니라 복부 tegmental 지역 substantia 니그라 (그림 1D)의 dopaminergic 세포 집단의 주변에 (보고 등 많은 midbrain 구조에 상승을 제공합니다 또한 2004) Zervas. 대조적으로, E9.5에 표시된 Wnt1 - 일족이 열등 colliculi뿐 아니라 dopaminergic 세포 집단 (그림 1 층)의 주변 뉴런에 상승을 제공합니다.
그림 1 Wnt1 - 운명 매핑을위한 대표 결과. :
Wnt1 - CreERT에서 전체를 탑재하고 immunocytochemistry 결과의 예, mGFP 배아 및 E8.5 (AD)에 (로 표시) 매핑 성인 두뇌의 운명그리고 E9.5 (EF). A. Wnt 1 크리어, E12.5 전시 GFP의 주로 midbrain에서 형광 (MB), 후부 hindbrain (HB)과 척수 (SP)에서 mGFP의 배아. B. 표시 전지는 시각이 1 μm의 두께 광학과 (40x 목표, Z - 시리즈 취득)에 같이 immunohistochemistry하여 세포 수준에서 분석했다. 원자력 β - galactosidase (nβ - 여자) 항체 라벨 (적색)과 GFP 항체 라벨 (녹색)은 복부 midbrain에 표시된 운명을 매핑 세포를 나타냅니다. 여기 recombined 세포 때문에 조건부 mGFP 기자의 성격 (nβ - 걀 + / GFP +) 이중 긍정적인 수 있습니다. C. 전체 - 마운트 개화 현미경은 성인의 우수한 colliculi (SC) (삽입된 페이지)에서 희미한 GFP의 형광을 나타낸다. 낮은 배율로 성인 섹션에 E8.5에 표시된 Wnt1의 혈통 평가 (5 배) 현미경은 Wnt1의 혈통은 (SC) 우수와 열등 (IC)를 포함 colliculi midbrain 구조로 상승 준 보여줍니다 (C). nβ - 여자 + 세포와 풍부한 GFP + axonal 신경 얼기와 dopaminergic 뉴런의 주변에있는 복부 midbrain에서 가져온 D. 40x, 1mm 광학 섹션을 참조하십시오. 쉽게 전체 마운트 형광 (삽입된 페이지)의 midbrain의 열등한 colliculus에서 관찰됩니다 상당한 GFP 라벨에 E9.5 결과에서 E. 표시. 낮은 배율 (배) 현미경 (E)로 볼 수로 성인 섹션 (β - 여자 +, 빨강)에 E9.5에 표시된 Wnt1의 혈통은 하부 colliculus (지느러미 - 후부 midbrain)에 집중되어 있습니다. nβ - 여자 + 세포와 풍부한 GFP + axonal 신경 얼기와 dopaminergic 뉴런의 주변에있는 복부 midbrain에서 가져온 F. 40x, 1mm 광학 섹션을 참조하십시오. Wnt1의 혈통은 복부 midbrain에 기여에 지속하면서 E8.5 대 E9.5에 표시된 Wnt1 - 파생 뉴런은 점차적으로, 지느러미 midbrain에 공헌에서 제한됩니다.
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Discussion
우리가 보여준 그 GIFM 시스템은 셀룰러 프로세스의 다양한 질문에 다양한 답변을하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 Cre 호텔 드라이버 엔지니어링 생쥐는 모든 세포 유형, 조직 또는 관심있는 유전자 혈통을 대상으로 사용할 수 있습니다. tamoxifen 어떤 배아 또는 출생 후의 시점에 시행 될 수 있기 때문에 또한, 재조합은 어떤 관련이 발달 단계에 타겟팅할 수 있습니다. 이 시스템의 공간과 시간적 제어 특정 유전자를 표현하는 세포가 관심을뿐만 아니라, 개발하는 동안 셀 마이 그 레이션 및 patterning 이벤트 구조 또는 지역에 기여하는 방법은 조사에 이상적입니다.
단순히 immunohistochemistry (그림 1)에 의해 세포를 표시하고 시각 이외에도, GIFM 방법론은 다양한 어플 리케이션에 사용될 수 있습니다. 조건부 노크 아웃 allele와 GIFM를 결합함으로써 유전 손실 기능 temporally 수 있으며 동시에 공간 기자 allele으로 표시됩니다 관련 세포 집단, 타겟으로. 또는 운명 매핑 동물에서 수집한 조직은 물리적으로 별개의 집단으로 기자 유전자 또는 특정 마커를 표현하는 세포를 분리하기 위해 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)와 함께 사용할 수 있습니다. embryogenesis 동안 또는 성인 동물로부터 격리 표시된 조직은 체외에서 정의 lineages하는 약물이나 유전자 구성의 배포를 허용, 교양 수 있습니다.
우리 연구실은 파킨슨병의 질병, 정신 분열증, 자폐증과 결절 경화증과 같은 신경계 질환에 의해 인한 복잡한 문제에 대한 해답을 얻을 수 있도록 GIFM 연구에서 얻은 결과를 사용합니다. 세포의 인구가이 질환의 각 방법과 이러한 인구 마우스 모델에서 시간이 지남에 따라 변화하는 영향을 이해함으로써, 우리는 더 병리가 준수하고 심지어 임상 설정에서 치료 가능한 수단을 포즈 이해하기 바랍니다.
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Disclosures
모든 저자는 동등하게이 작품에 기여하고 알파벳순으로 나열됩니다. 각 개인의 공헌은 그의 혹은 비디오 문서에 그녀의 참여에 의해 분명합니다.
Acknowledgments
우리는 mGFP 마우스에 대한 S. 아버하고 비판적으로 신문을 읽고 기술 지원을 제공하는 Zervas 연구실의 구성원에 감사하고 있습니다. A. 브라운은 뇌 과학 카플란 여름 대학원 연구 상을 지원했다. E. 노르망는 뇌 과학 프로그램 대학원 연구 상을 지원했다. 이 연구는 또한 시동 연구 자금 (MZ)에 의해 재정 지원되었다.
References
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
