Summary
Genetiska inducerbara Fate Mapping (GIFM) märken och spår celler med fina tid och kontroll
Abstract
Ödet kartor genereras av märkning och spårning av celler in vivo för att avgöra hur stamceller bidrar till specifika strukturer och celltyper i att utveckla och vuxen vävnad. Ett förskott i detta begrepp är G enetic jag nducible F åt M apping (GIFM) som förbinder genuttryck, cell öde och beteenden cell in vivo, för att skapa öde kartor som bygger på genetisk härstamning.
GIFM utnyttjar X-CreER linjer där X är en gen eller en uppsättning gener reglerande element som ger rumsliga uttryck för en modifierad bakteriofag protein, Cre recombinase (CreER T). CreER T innehåller en modifierad e strogen r eceptor ligandbindande domänen som gör CreER T bundet i cytoplasman i avsaknad av läkemedlet tamoxifen. Bindningen av tamoxifen releaser CreER T, som translocates till kärnan och förmedlar rekombination mellan DNA-sekvenser flankeras av loxP webbplatser. I GIFM sker rekombination vanligtvis mellan en loxP flankeras Stoppa kassetten innan en reporter gen som GFP.
Möss är avlade för att innehålla antingen en region-eller cell typspecifika CreER och en villkorlig reporter allel. Obehandlad möss kommer inte att ha märkning eftersom Stoppa kassetten i reportern förhindrar ytterligare utskrift av reporter genen. Vi administrerar tamoxifen via oral sondmatning till tidsinställd-dräktiga honor, vilket ger temporal kontroll över CreER T utsläpp och efterföljande translokation till kärnan bort Stoppa kassetten från reportern. Efter rekombination är reporter allelen konstitutivt och heritably uttryckt. Denna serie av händelser markerar celler så att deras genetiska historia outplånlig spelas in. Den rekombinerat reporter fungerar alltså som en high fidelity genetisk härstamning spårämne som, när den är frikopplas från genuttryck användes ursprungligen för att driva CreER T.
Vi tillämpar GIFM i mus för att studera normal utveckling och fastställa bidrag genetiska linjerna till vuxen celltyper och vävnader. Vi använder också GIFM följa celler på mutant genetisk bakgrund för att bättre förstå komplexa fenotyper som efterliknar framträdande dragen i människans genetiska sjukdomar.
Denna video artikeln vägleder forskare genom experimentella metoder att framgångsrikt ansöka GIFM. Vi visar metoden att använda vår välkarakteriserade Wnt1-CreER T; mGFP möss genom att administrera tamoxifen på embryonala dag (E) 8,5 via oral sondmatning följt av dissektion vid E12.5 och analys med epifluorescence stereomikroskopi. Vi visar också hur mikro-dissekera öde kartlagda områden för Explantation förberedelser eller FACS analys och dissekera vuxna öde-mappade hjärnor för hela montera lysrör avbildning. Tillsammans står dessa förfaranden låta forskare att hantera kritiska frågor i utvecklingsbiologi och modeller sjukdom.
Protocol
Tamoxifen Beredning och oral sondmatning Procedure (E8.5)
- Förbered en 20 mg / ml stamlösning av tamoxifen genom att lösa tamoxifen i förvärmda majsolja.
- Inkubera vid 37 ° C under 2 timmar på en nutator och vortexa intermittent.
- Skydda tamoxifen lager från ljus, förvara vid 4 ° C och i upp till en månad.
- För experiment öde kartläggning, upprätta ett avelspar som består av en schweizisk Webster hona (wildtype, köpt från Taconic) och en manlig bär både en gen specifik CreER T-allelen och en reporter allel. För demonstrationsändamål använder vi Wnt1-CreER T; mGFP män (Ellisor 2009).
- Kontrollera schweiziska Webster honor varje morgon för uppkomsten av en vaginal kontakt. Utse morgonen (0900) av dagen en vaginal kontakten ses som 0,5 dagar efter samlag och beräkna datum för tamoxifen förvaltningen på grundval av denna utgångspunkt. (För det här experimentet var embryonala dag 8,5 används).
- Använd en 1 ml spruta med en djurfoder nål (20G x 1-1/2) att upprätta 200 ìl av tamoxifen stamlösningen (4 mg tamoxifen).
- Ordentligt fast den gången-gravida schweiziska Webster kvinnliga genom att greppa nacken och tillbaka till immobilisera huvudet och vänd så den ventrala sidan är vänd uppåt.
- Håll svansen mellan fria fingrar för att hålla kroppen i en rak linje.
- Placera utfodring nålen i mungipan och försiktigt styra nålen längs gommen.
- Vrid nålen så att den är parallell med kroppen, samtidigt luta huvudet bakåt för att hålla nacken rak.
- Guide nålen ner i matstrupen, mot magen. Var noga med att inte komma in i luftstrupen. Om det finns motstånd på nålen, djurets gag engagerar reflex, eller om musen kamper, omedelbart ta bort nålen och prova sondmatning igen.
- När utfodring nål i magen, administrera tamoxifen i magen och tillbaka honan till hennes hem buren fram till dagen för dissekering.
Kraniotomi:
- Intracardially BEGJUTA den vuxna öde kartlagda mus med 4% PFA och ta bort huvudet med en sax genom att skära igenom ryggraden strax ovanför axlarna.
- Kör en skalpell längs ryggens mittlinje huvudet (rostralt till stjärtfenan) att skära igenom hårbotten och exponera skalle.
- Med hjälp av skalpell, skrapa bort överflödigt vävnad eller muskler från längs sidan och bakre delen av kraniet.
- Med pincett, punktera skallen vid mittlinjen bara rostralt om lukt glödlampor och skapa ett litet hål för att rymma de tips av fina sax.
- Sätt in den fina saxen i detta hål och göra ett snitt medialt till lateralt ungefär längden på luktsinnet glödlampor. Denna nedskärning kommer att bryta skallen i korsningen av näsans ben och pannbenet och ge god tillgång till sax.
- Klipp längs sagittal suturerna i skallen (dorsala mittlinjen) och se till att hålla sax tips vinklade bort från hjärnan för att inte skada den underliggande vävnaden.
- Ta försiktigt tag i skallen med pincett och skala bort benet längs mediala snittet att exponera hjärnan. Skallen kan chipet av i små bitar eller bryta i större sektioner. Fortsätta använda pincett för att ta bort alla av fronten, parietalceller, interparietal och skallbenet ben.
- Knäcka benen innesluter paraflocculi (längs sidorna av hjärnan i nivå med lillhjärnan) genom att klämma den sfäriska ben på varje sida. Dra försiktigt bort benen.
- Vänd huvudet upp och ned (ryggsidan nedåt) och använd pincett att kapa de kranialnerver och släpper hjärnan ur skallen.
Hela Mount Mikroskopi: vuxna hjärnan
- Bedöm vuxna hjärnan för GFP-märkning med hjälp av en fluorescerande dissekera omfattning.
- Överför hjärnan till en petriskål med PBS och fotografi med PictureFrame eller annan lämplig programvara.
Hela Mount Mikroskopi: E12.5 embryon
- Utvärdera hela montera embryon för GFP-märkning med hjälp av en fluorescerande dissekera omfattning.
- Överför de som GFP positiva med hela berget till en petriskål med PBS och fotografi med PictureFrame eller annan lämplig programvara.
- Använd pincett för att nypa bort en liten bit av svansen från varje embryo, placera varje del i en PCR-rör och genotyp vävnad med PCR (Ellisor 2009) för båda allelerna för att bekräfta resultaten ses via hela montera analys.
Micro-dissekering och Explantation förberedelse av ventrala mesencephalon från E12.5 embryon
- Efter dissektion från livmoder kedjan och identification av öde-mappade embryon genom hela-fäste fluorescens, överföra embryon till iskalla steril PBS i en cellkultur maträtt.
- Använda fina saxar, ta bort huvudet delen av embryot skära tvären, stjärtfenan till rhombomere 1.
- Därefter tar du bort rostralt delen av huvudet med en coronal skar genom diencephalon. Detta kommer att utsätta en tub-liknande struktur där den 4: e ventrikeln genom mesencephalic vesikler bildar en kanal mellan rygg-och ventrala vävnader.
- Sätt försiktigt i sax tips till den 4: e ventrikeln, och klipp längs ryggens mittlinje, caudal till rostralt, fullt öppna röret, vilket skapar en "öppen bok" förberedelse. Den ventrala mesencephalon kommer nu att utsättas medialt, medan de två dorsala halvorna av mesencephalon ska bo i sidled.
- Ta bort alla återstående icke-nervvävnad under ventrala mesencephalon för att vävnaden att lägga mer blankt. Om det behövs, göra hack i rostralt och stjärtfenan aspekter så att ryggen "vingar" av Explantation kommer att ligga platt också. Den Explantation bör nu likna en "fjäril, där rygg mesencephalon representerar vingarna, och rhombomere 1 svansen.
- För att ytterligare isolera ventrala mesencephalon för FACS-analys eller cellförsök kultur, ta bort den laterala (dorsala aspekter) i vävnaden.
Representativa resultat:
I detta GIFM experiment Wnt1-uttryckande celler är permanent och heritably märkt under fosterutvecklingen genom att administrera tamoxifen vid E8.5 till Wnt1-CreERT, mGFP embryon. Därefter dessa markerade celler visualiseras genom hela berget fluorescens och avsnitt immunohistokemi för att avgöra hur Wnt1 som härrör från celler bidrar till att neurala strukturer i utvecklingen. Hela montera fluorescens förlitar sig på den bundna membranet GFP del av mGFP reporter och ger därför cellulär information samt en övergripande syn på Wnt1-derived neurala prognoser. Till exempel med tamoxifen förvaltning på E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embryon vid E12.5 uppvisar GFP fluorescens främst i mellanhjärnan, bakre hindbrain och ryggmärgen (Figur 1A). Vid hög förstoring, är fina neuronala prognoser sett innervating mellanhjärnan, kroppen vägg, lem och kraniofaciala regionen. I det här utvecklingsstadiet, är embryot genomskinlig och interna GFP märkning är lätt att urskilja. Men eftersom hjärnan utvecklas, skymmer tätheten av mogna vävnad GFP fluorescens som härrör från interna hjärnstrukturer. Därför med tamoxifen förvaltning på E8.5 är endast mindre GFP märkning observerats i de överlägsna colliculi av den vuxna genom hela montera fluorescens (figur 1C, infälld). Dessutom är vissa axonal prognoser sett Coursing längs ventrala yta hindbrain (visas inte). Däremot när tamoxifen ges på E9.5 sker betydande GFP märkning i hela underlägsna colliculi (Figur 1B, infälld). Denna ökning i hela montera fluorescens kan tyda på att Wnt1-uttryckande celler vid E9.5 bidra avsevärt till ytliga regioner i dorsala mitthjärnan eller förlänga flera processer inom denna region än Wnt1 uttrycka celler från E8.5. Oavsett speglar denna skillnad i hela montera fluorescens den dynamiska karaktären hos Wnt1 uttryck under utveckling och visar hur GIFM kan användas för att följa olika cellpopulationer från embryo till mogna vuxna.
Med immunohistokemi, öde kartlagt vävnadssnitt från Wnt1-CreERT, är mGFP djur analyseras på cellnivå. Antikroppar mot GFP och β-galaktosidas (β-gal) används tillsammans med en rad olika vävnad specifika biomarkörer för att bestämma finskaliga cellulära bidrag Wnt1 härstamning till neurala strukturer och celltyper. Med tamoxifen administration på E8.5 och vävnad analys vid E12.5, dubbla positiva celler (GFP + och β-gal +) observeras under hela mitthjärnan och hindbrain med prognoser for genom den ventrala mitthjärnan (Figur 1B). I den vuxna hjärnan, ger Wnt1-linjen märkt på E8.5 upphov till många mitthjärnan strukturer inklusive de överlägsna och underlägsna colliculi samt i närheten av dopaminerga celler populationer av ventrala tegmentumområdet och substantia nigra (figur 1D) (se också Zervas 2004). Däremot ger den Wnt1-linjen märkt på E9.5 upphov till sämre colliculi samt att nervceller i närheten av dopaminerga cellpopulationer (Figur 1F).
Figur 1 representativa resultat för Wnt1-öde kartläggning.:
Exempel på hel-fäste och resultat immuncytokemi i Wnt1-CreERT, mGFP embryon och vuxna hjärnor öde kartläggas (markerat) på E8.5 (AD)och E9.5 (EF). A. Wnt 1-CreER, mGFP embryon vid E12.5 uppvisar GFP fluorescens främst i mitthjärnan (Mb), bakre hindbrain (Hb) och ryggmärgen (SP). B. Markerade celler visualiseras och analyseras på cellulär nivå genom immunhistokemi som visas på denna 1-ìm tjock optisk avsnitt (40x objektiv, Z-serien förvärv). Kärn β-galaktosidas (nβ-gal) antikropp märkning (röd) och GFP antikroppar märkning (grön) indikerar öde-mappade cellerna visas i ventrala mitthjärnan. Här rekombinerat celler dubbla positiva (nβ-gal + / GFP +) på grund av arten av det villkorade mGFP reporter. C. Hela montering BLOMNINGSTID mikroskopi visar svagt GFP fluorescens i den överlägsna colliculi (SC) av de vuxna (infälld). Bedöma Wnt1 linjen markerad på E8.5 på vuxna sektioner med låg förstoring (5X) mikroskopi visar att Wnt1 härstamning ger upphov till mitthjärnan strukturer inklusive den överlägsna (SC) och sämre (IC) colliculi (C). D. En 40x, 1 mm optisk avsnitt tas från ventrala mitthjärnan i närheten av dopaminerga nervceller med nβ-gal + celler och ett rikt GFP + axonal plexus. E. märkning i E9.5 resulterar i betydande GFP märkning som lätt kan observeras i sämre colliculi av mitthjärnan genom hela montera fluorescens (infälld). Den Wnt1 härstamning markerade på E9.5 på vuxna sektioner (β-gal +, röd) är koncentrerad till de lägre colliculi (dorsala-posterior mitthjärnan) som ses med låg förstoring (5X) mikroskopi (E). F. En 40x, 1 mm optisk avsnitt tas från ventrala mitthjärnan i närheten av dopaminerga nervceller med nβ-gal + celler och ett rikt GFP + axonal plexus. Wnt1-derived nervceller markerade på E8.5 kontra E9.5 successivt begränsas från att bidra till dorsala mitthjärnan, medan Wnt1 härstamningen framhärdar i att bidra till ventrala mitthjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det GIFM system som vi har visat kan användas för att besvara en rad frågor i olika cellulära processer. Till exempel kan möss konstruerad med olika Cre förare kan användas för att rikta alla celltyper, vävnader eller genetisk härstamning av intresse. Dessutom, eftersom tamoxifen kan administreras när som embryonala eller postnatal tidpunkt kan rekombination riktas till alla relevanta utvecklingsstadiet. Den rumsliga och tidsmässiga kontrollen av detta system är idealiska för att undersöka hur celler som uttrycker vissa gener bidrar till en struktur eller en region av intresse samt cell migration och mönstring händelser under utveckling.
Förutom att helt enkelt märkning och visualisera celler genom immunohistokemi (Figur 1), kan GIFM metoder användas för en mängd olika applikationer. Genom att kombinera GIFM med en villkorlig knock-out-allelen kan genetisk bortfall av funktionen tidsmässigt och rumsligt riktade mot relevanta cellpopulationer, som samtidigt är markerade med en reporter allel. Alternativt kan vävnad som samlats in från öde kartlagda djur användas i kombination med fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) att fysiskt isolera celler som uttrycker reporter gener eller särskilda markörer i skilda populationer. Markerade vävnader isolerade under fosterutvecklingen eller från vuxna djur kan odlas, för leverans av läkemedel eller genetiska konstruktioner till definierade härstamningar in vitro.
Vårt labb använder resultaten från GIFM studier för att hjälpa till att besvara komplexa frågor från neurologiska sjukdomar som Parkinsons sjukdom, schizofreni, autism och tuberös skleros. Genom att förstå vilka populationer av celler påverkas i alla dessa sjukdomar och hur dessa populationer förändras över tiden i musmodeller, hoppas vi att bättre förstå patologin observerade och även utgöra möjliga sätt av behandlingen i kliniska situationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har bidragit lika för detta arbete och är listade i alfabetisk ordning. Bidraget från varje enskild framgår av hans eller hennes medverkan i videon artikeln.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för S. Arber för mGFP möss och till medlemmar i Zervas labb som kritiskt läsa tidningen och gav tekniskt bistånd. A. Brown fick stöd av en Brain Science Kaplan Sommar Graduate Research Award. E. Normand stöddes av en Brain Science Program Graduate Research Award. Denna forskning har också finansierats av start forskningsmedel (MZ).
References
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
