Summary
Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama (GIFM) işaretleri ve ince, mekansal ve zamansal kontrolü ile parça hücreleri
Abstract
Kader haritalar atalarıdır, gelişmekte olan ve yetişkin doku özel yapılar ve hücre tiplerinin nasıl katkıda belirlemek için, in vivo hücre işaretleme ve izleme tarafından üretilir. Bu kavramı bir ilerleme genetik soy dayalı kaderi haritaları oluşturmak için, F, M aritalandırma (GIFM) gen ekspresyonu, hücre kaderi, ve in vivo hücre davranışları birbirine bağlayan yedik nducible, G enetic.
GIFM patlatır X-CreER hatları burada X, değiştirilmiş bir bakteriyofaj protein, Cre recombinase (CreER T) mekansal ifade bahşeder gen ya da gen düzenleyici elemanlar bir set. CreER T, T CreER kılan bir değiştirilmiş bir e strogen r eceptor ligand bağlayıcı etki alanı içeren ilaç tamoksifen yokluğunda sitoplazma saklamış. LoxP siteleri tarafından çevrili DNA dizilimleri arasındaki çekirdek ve aracılık rekombinasyon translocates tamoksifen bültenleri CreER T, bağlayıcı değildir. LoxP bir muhabir gibi GFP geninin önceki kaset Dur çevrili arasında GIFM, rekombinasyon genellikle oluşur.
Fare, bir bölge veya hücre tipine özgü CreER ve koşullu bir muhabir aleli içeren cins vardır . Muhabir Durdur kaset muhabir gen transkripsiyonu önler, çünkü tedavi görmeyen farelere işaretleme olmayacaktır. CreER T serbest bırakılması ve muhabir Durdur kaset çıkarmadan çekirdeğine sonraki translokasyon zamansal kontrolü sağlar zamanlı hamile kadın, ağızdan sonda ile tamoksifen yönetmek. Rekombinasyon sonra, muhabir allel yapısal ve heritably ifade. Bu olaylar dizisi, bu tür hücrelerin genetik geçmişi silinmez kayıtlı olduğunu işaret ediyor. Recombined muhabiri, böylece, bir kez, başlangıçta CreER T sürmek için kullanılan gen ekspresyonu çözüldükten bir yüksek sadakat genetik soy tracer olarak hizmet vermektedir.
Biz genetik soy, yetişkin hücre tipleri ve dokuların normal gelişimini ve katkısını tespit çalışma fare GIFM geçerlidir. Ayrıca hücreleri mutant genetik kökenden insan genetik bozukluklar göze çarpan özellikleri taklit karmaşık fenotipleri daha iyi anlamak için takip etmek GIFM kullanabilirsiniz.
Deneysel yöntemlerle kılavuzları Bu video makalede araştırmacılar başarıyla GIFM uygulamak için. Biz iyi karakterize Wnt1-CreER T yöntemi kullanarak göstermek; E12.5 diseksiyon ve Epifloresans stereomicroscopy analiz ağızdan sonda ile embriyonik gün (E) 8.5 tamoksifen idare tarafından mGFP fareler. Ayrıca eksplant hazırlama veya FACS analiz kaderi eşlenen etki alanı mikro-incelemek ve tüm montaj floresan görüntüleme için yetişkin kader eşlenen beyinleri teşrih nasıl göstermektedir. Toplu olarak, bu işlemler, araştırmacılar, gelişim biyolojisi ve hastalık modelleri kritik soruları yanıtlamak için izin verir.
Protocol
Tamoksifen hazırlanması ve ağızdan sonda Prosedürü (E8.5)
- Önceden ısıtılmış mısır yağı tamoksifen eriterek tamoksifen bir 20 mg / ml stok solüsyonu hazırlayın.
- 37 ° çözüm inkübe ° C nutator ve aralıklı olarak vorteks üzerinde 2 saat.
- 4 ışık, mağaza ° C tamoksifen stok koruyun ve bir aya kadar kullanabilirsiniz.
- Bir genin özel CreER T alleli ve bir muhabir aleli taşıyan bir erkek; kaderi haritalama deneyler için, Swiss Webster kadın (Taconic satın wild tip) oluşan bir üreme çifti kurmak. MGFP erkek (Ellisor 2009); gösteri amaçlı Wnt1-CreER T kullanıyorsanız.
- İsviçre Webster kadın, vajinal bir fiş görünüm için her sabah kontrol edin. Vajinal fiş 0.5 gün sonrası cinsel birleşmede olarak görülüyor günün sabahı (0900) belirleyin ve bu başlangıç noktasına göre tamoksifen tarihini hesaplamak. (Bu deneme için, kullanılan embriyonik gün 8,5).
- Tamoksifen stok solüsyonu (4 mg tamoksifen) 200 ul yukarı çekmek için bir hayvan besleme iğne (20G x 1-1/2) ile 1 ml şırınga kullanın.
- Boynun ense tutarak sıkıca zaman hamile Swiss Webster kadın dizginlemek ve başın arka tarafında hareketsiz ve ventral yüzü yukarı bakacak şekilde ters çevirin.
- Vücudu düz bir çizgide tutmak için ücretsiz parmaklar arasında kuyruk tutun.
- Beslenme iğne ağız köşeye yerleştirin ve yavaşça ağız çatı boyunca iğne kılavuzu.
- Vücuda paralel olacak şekilde aynı anda baş eğerek geri boynun düz tutmak için ise, iğne döndürün.
- Mide doğru, yemek borusu aşağı iğne Kılavuzu. Trakea girmek için dikkatli olun. Iğne, hayvan öğürme refleksi yürütmektedir veya fare mücadeleleri ise, iğneyi hemen çıkarın ve sonda tekrar deneyin direnç varsa.
- Besleme iğne midede sonra mideye tamoksifen yönetmek ve diseksiyon tarihe kadar kadın evine kafesine geri dönmek.
Kraniotomi:
- Intrakardiyak yetişkin kaderi% 4 PFA eşlenen fare serpmek ve omuzlar üzerinde omuriliğe ile kesme makası ile baş kaldırmak.
- Kesilmiş ve kafa derisi ile kafatası açığa çıkarmak için kafa (kaudal için rostral) dorsal orta hat boyunca bir neşter çalıştırın.
- Neşter kullanarak, kafatası yan ve arka boyunca herhangi bir aşırı doku veya kas kazınması gerekir.
- Ponksiyon forseps, sadece koku ampuller rostral ve ince makas ipuçları karşılamak için küçük bir delik oluşturmak orta hatta kafatası.
- Ince makas, bu deliğin içine yerleştirin ve yaklaşık uzunluğu koku ampuller lateral medial bir kesi yapmak. Bu kesim, burun kemik ve frontal kemik kesiştiği kafatası kırmak ve makas için iyi erişim sağlayacak.
- Altta yatan doku zarar görmesini önlemek için, beyin uzak açılı makas ipuçları tutmak için emin olun kafatası (dorsal orta hat) sagital sütür boyunca kesin.
- Beyin yavaşça ortaya çıkarmak için medial insizyon boyunca kemik forseps ve uzakta kabuğu kafatasını kavramak. Kafatası, küçük parçalar halinde kapalı çip ya da daha büyük bölümlerde uzak kırılabilir. Frontal, parietal interparietal ve oksipital kemiklerin tümünü kaldırmak için forseps kullanarak devam edin.
- Paraflocculi (beyincik seviyesinde beynin lateral kenarlarında bulunan) her iki tarafta küresel kemikleri kısma encasing kemikleri Crack. Kemikler yavaşça çekin.
- Baş baş aşağı çevirin (dorsal yüzü aşağı) ve kraniyal sinirlerin sever ve kafatası beyin çıkarmak için forseps kullanabilir.
Tüm Mount Mikroskopi: Yetişkin Beyin
- GFP işaretlemesi yetişkin beyin floresan diseksiyon kapsamı kullanarak değerlendirin.
- PBS ve diğer uygun yazılım kullanarak PictureFrame veya fotoğraf içeren bir Petri çanak beyin aktarın.
Tüm Mount Mikroskopi: E12.5 Embriyolar
- GFP işaretlemesi için tüm montaj embriyolar floresan diseksiyon kapsamı kullanarak değerlendirin.
- PBS ve diğer uygun yazılım kullanarak PictureFrame veya fotoğraf içeren bir Petri kabı bütün montaj pozitif GFP bu aktarın.
- Forseps kullanımı, her embriyo küçük bir parça kuyruk çimdik PCR tüp içinde her parçanın yeri ve genotip tüm montaj analizi ile görülen sonuçları doğrulamak için, her iki allel için PCR (Ellisor 2009) kullanarak doku.
Mikro-disseksiyon ve eksplant hazırlama E12.5 embriyolar ventral mezensefalon
- Diseksiyonu takiben rahim zinciri ve idbütün montaj floresan, buz gibi bir hücre kültürü çanak steril PBS transfer embriyolar kader eşlemeli embriyoların entification.
- Rhombomere 1 kaudal enine kesme embriyonun baş kısmı, ince makas kullanarak, çıkarın.
- Sonra, diensefalon aracılığıyla koronal kesilmiş baş rostral bölümü çıkarın. Bu bir tüp benzeri yapı mezensefalik vezikül dorsal ve ventral dokular arasında bir kanal ile 4. ventrikül gösterecektir
- Makas ipuçlarını dikkatli bir şekilde, dorsal orta hat boyunca rostral için kaudal 4. ventrikül ve snip, tam bir "açık-kitap" hazırlanması oluştururken, tüp açma takın. Mezensefalon iki dorsal yarısı yanal bulunacağı ventral mezensefalon mediale maruz olacaktır.
- Ventral doku için daha kesin bir dille yatıyordu mezensefalon altında kalan non-nöral doku çıkarın. Eğer gerekirse, eksplant dorsal "kanatlarını" de düz koymak olacağını rostral ve kaudal yönleriyle çentikler olun. Eksplant "dorsal mezensefalon kanatları temsil eden bir kelebek, ve rhombomere 1 kuyruk benzer.
- Ventral mezensefalon FACS analiz veya hücre kültürü deneyleri için daha fazla izole etmek için, doku lateral (dorsal) çıkarın.
Temsilcisi Sonuçlar:
Bu GIFM deneyde, Wnt1-ifade hücreleri kalıcı ve heritably E8.5 Wnt1-CreERT tamoksifen idare tarafından embriyogenez sırasında belirgin mGFP embriyolar. Daha sonra bu işaretlenmiş hücreler hücreleri sinir yapılarının gelişme karşısında nasıl katkıda Wnt1-kökenli belirlemek için tüm montaj floresan ve bölüm immünhistokimya ile görüntülendi. Tüm montaj floresan mGFP muhabiri membran bağlı GFP bileşeni dayanmaktadır ve bu nedenle hücresel bilgilerin yanı sıra, Wnt1-kaynaklı nöral projeksiyonlar görüşünü sağlar . Örneğin, öncelikle, orta beyin, arka arka beyin ve omurilik (Şekil 1A) E12.5 sergi GFP floresan E8.5, Wnt1 CreERTmGFP embriyolar tamoksifen . Yüksek büyütmede, ince nöronal projeksiyonları, orta beyin, vücut duvar, kol, bacak ve kraniyofasiyal bölge innerve görülür. Bu gelişimsel aşamada, embriyo şeffaf ve iç GFP etiketleme kolayca ayırt edilir. Ancak, beyin geliştikçe, olgun doku yoğunluğu iç beyin yapıları kaynaklanan GFP floresan gizler. Bu nedenle, E8.5 tamoksifen, sadece küçük GFP etiketleme tüm montaj floresans (Şekil 1C, içerlek) yetişkin üstün colliculi görülmektedir. Buna ek olarak, bazı aksonal projeksiyonlar Beyin ventral yüzeyi boyunca akan (gösterilmemiştir) görülmektedir. Buna karşılık, tamoxifen E9.5 verildiğinde, önemli GFP etiketleme tüm inferior colliculi (Şekil 1B, içerlek) boyunca oluşur. Bütün montaj floresan Bu artış gösterebilir Wnt1 ifade E9.5 az hücreler dorsal orta beyin yüzeysel bölgelere daha E8.5 gelen Wnt1 ifade hücrelerden daha önemli ölçüde katkıda bulunan veya bu bölgede daha fazla süreçleri uzatmak . Ne olursa olsun, tüm montaj floresan bu fark gelişimi sırasında Wnt1 ifade dinamik doğasını yansıtır ve GIFM olgun yetişkin içine embriyo farklı hücre popülasyonlarının izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor.
Wnt1-CreERT immünohistokimya, kader eşlenen doku kesitlerinde; mGFP hayvanlar hücresel düzeyde analiz edilmektedir. GFP ve β-galaktosidaz (β-gal) karşı antikorlar, sinir yapıları ve hücre tipleri Wnt1 soy ince çaplı hücresel katkısını belirlemek için çeşitli doku spesifik biyobelirteçleri bir ile birlikte kullanılır . E12.5 az E8.5 tamoksifen ve doku analizleri ile çift pozitif hücrelerin (GFP + ve β-gal +), ventral orta beyin (Şekil 1B) dolaşmakta projeksiyonları ile orta beyin ve arka boyunca gözlenir. E8.5 işaretlenmiş Wnt1 soy yetişkin beyin superior ve inferior colliculi yanı sıra, ventral tegmental alan ve substantia nigra (Şekil 1D) dopaminerjik hücre popülasyonlarının çevresinde (bkz. dahil olmak üzere pek çok orta beyin yapıları doğurur 2004) Zervas. Buna karşılık, E9.5 işaretlenmiş Wnt1 soy aşağı colliculi dopaminerjik hücre popülasyonlarının (Şekil 1F) çevresinde nöronların yanı sıra yol açmaktadır.
Şekil 1 Wnt1-kaderi haritalama Temsilcisi Sonuçları:
Wnt1-CreERT tüm montaj ve immünhistokimya sonuçları Örnekler; mGFP embriyo ve yetişkin beyinlerini kaderi E8.5 (AD) eşlenen (işaretli)E9.5 (EF). A. Wnt 1-CreER, öncelikle orta beyin E12.5 sergi GFP floresan (Mb), arka arka beyin (Hb) ve spinal kord (Sp) mGFP embriyolar. B. İşaretli hücreleri görüntülendi ve bu 1 mikron kalınlığında optik bölümü (40x amacı, z-serisi satın alma) gösterildiği gibi immünohistokimya ile hücresel düzeyde analiz. Nükleer β-galaktosidaz (nβ galon) antikor etiketleme (kırmızı) ve GFP antikor etiketleme (yeşil), ventral orta beyindeki gösterilen kaderi eşleşmiş hücrelere gösterir. Burada yeniden birleştirilmesi, hücreleri koşullu mGFP muhabiri doğası nedeniyle (nβ-gal + / GFP +) çift pozitif. C. Tüm montaj floresans mikroskopisi yetişkin üstün colliculi (SC) (inset) soluk GFP floresan ortaya koymaktadır. (C) düşük büyütme yetişkin bölümlerde E8.5 işaretlenmiş Wnt1 soy Değerlendirilmesi (5X) mikroskopi Wnt1 soyu (SC), üstün ve aşağı (IC) colliculi de dahil olmak üzere orta beyin yapıları sebebiyet verdiğini ortaya koymaktadır. D. A nβ-gal + hücreleri ve zengin bir GFP + aksonal pleksus dopaminerjik nöronların çevresinde ventral orta beyin alınan 40x, 1 mm optik bölüm. E. kolayca bütün montaj floresan (inset) tarafından Ortabeyin inferior colliculus gözlenen önemli GFP etiketleme E9.5 sonuçları Markalama. Düşük büyütme (5X) mikroskobu (E) görüldüğü gibi yetişkin bölümler (β-gal +, kırmızı) E9.5 işaretlenmiş Wnt1 soy inferior colliculus (dorsal-arka orta beyin) yoğunlaşmıştır. F. A nβ-gal + hücreleri ve zengin bir GFP + aksonal pleksus dopaminerjik nöronların çevresinde ventral orta beyin alınan 40x, 1 mm optik bölüm. E8.5 karşı E9.5 işaretlenmiş Wnt1-türevli nöronlar ventral orta beyin katkıda Wnt1 soy devam ederken, kademeli olarak, dorsal orta beyin katkıda sınırlı .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olduklarını ortaya koyduk GIFM sistemi geniş bir yelpazede hücresel süreçlerin çeşitli soruları cevaplamak için kullanılacak. Örneğin, farklı Cre sürücüleri ile mühendislik fareler, herhangi bir hücre tipi, doku veya ilgi genetik soy hedef kullanılabilir. Buna ek olarak, tamoksifen embriyonik ya da doğum sonrası herhangi bir zaman noktasında idare olabilir, çünkü, rekombinasyon, ilgili herhangi bir gelişme aşamasına hedef olabilir. Bu sistemin mekansal ve zamansal kontrol belirli genleri ifade hücrelerinin gelişimi sırasında hücre göç ve desenlendirme olayların yanı sıra ilgi bir yapı veya bölge nasıl katkıda araştırmak için idealdir.
Sadece immünhistokimya ile hücreleri (Şekil 1) işaretleme ve görüntülenmesine ek olarak, GIFM metodoloji, çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. GIFM bir koşullu knock-out alleli ile birleştirerek, genetik-fonksiyon kaybı zamansal ve mekansal olarak, aynı anda bir muhabir alleli ile işaretlenmiş ilgili hücre popülasyonlarının, hedeflenmiş. Alternatif olarak, fiziksel olarak farklı popülasyonları içine muhabiri genler ya da özellikle belirteçler eksprese eden hücrelerin izole kaderi eşlenen hayvanlardan toplanan doku Floresan-Aktif Hücre Ayırma (FACS) ile birlikte kullanılır olabilir. In vitro olarak tanımlanan soy ilaçlar ya da genetik yapıları teslim izin embriyogenez sırasında veya yetişkin hayvanların izole İşaretli doku, kültürlü olabilir.
Bizim laboratuarda, Parkinson hastalığı, şizofreni, otizm ve yumrulu skleroz gibi nörolojik hastalıklar, yarattığı karmaşık sorulara cevap yardımcı GIFM çalışmalardan elde edilen sonuçlar kullanır. Hücre popülasyonları, bu hastalıkların her birinin nasıl bu popülasyonların fare modelleri, zaman içinde değişiklik etkilenen hangi anlayış, patoloji gözlenen ve klinik ortamda tedavi bile mümkün demektir poz daha iyi anlamak için umut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar eşit olarak bu çalışmaya katkıda bulundu ve alfabetik olarak sıralanmıştır. Veya video makalede onun katılımı ile her bireyin katkısı açıktır.
Acknowledgments
Biz mGFP fareler için S. Arber ve kağıt eleştirel okuma ve teknik yardım sağladı Zervas laboratuar üyelerine teşekkür ediyoruz. A. Brown Beyin Bilim Kaplan Yaz Lisansüstü Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir. E. Normand Beyin Lisans Programı Lisansüstü Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir. Bu araştırma aynı zamanda başlangıç araştırma fonları (MZ) tarafından finanse edildi.
References
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
