Summary
我々は、バクテリオファージの複製システムのタンパク質によって媒介個々のDNA分子のリアルタイムレプリケーションを観察するための方法を説明します。
Abstract
我々は、バクテリオファージの複製システムのタンパク質によって媒介個々のDNA分子のリアルタイムレプリケーションを観察するための方法を説明します。線形化されたλDNAは、1つの鎖の端にビオチン、および同じ鎖のもう一方の端のジゴキシゲニンの部分を持つように変更されます。ビオチン化エンドは、官能ガラスのカバースリップと小さなビーズにdigoxigeninated末尾に添付されます。フローセルの表面上にこれらのDNA -ビーズテザーのアセンブリは、層流がビーズ上に抗力を発揮する適用することができます。その結果、DNAが近い引き伸ばされていると流量（図1）によって決定される力でカバースリップの表面に平行。 DNAの長さは、ビーズの位置を監視することにより測定されます。一本鎖および二本鎖DNAとの間の長さの違いは、フォークで複製タンパク質の活性のリアルタイム情報を取得するために利用されています。ビーズの位置を測定することで巻き戻しDNAと重合（図2）の速度とprocessivitiesの正確な測定が可能になります。
Protocol
1。 DNA複製のテンプレート
反応のためのDNAは、複製フォークを形成するオリゴヌクレオチドのアニーリングによって修正された直鎖状λのDNAです。さらに、ビオチンは、λのDNAの一方の鎖の端に取り付けられており、ジゴキシゲニンの部分は同じ鎖1の他端に接続されています。
材料：バクテリオファージλのDNA、オリゴヌクレオチド：ビオチン化フォークアーム（：5' -ビオチン- AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC - 3'）、λ-相補的なフォークアーム（B：5' - GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA - 3'）、フォークのプライマー（C：5' - TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC - 3'）、λ-相補的なジゴキシゲニンの終わり（D：5' - AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA -ジゴキシゲニン- 3'）、T4 DNAリガーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、ヒートブロック。
- T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドBとDの5'末端をリン酸化する。
- オリゴヌクレオチドとBの10倍過剰を追加することにより、ワンステップでλのDNA、およびT4 DNAリガーゼ緩衝液中のオリゴヌクレオチドCの100倍過剰にオリゴヌクレオチド、B、およびCをアニール。
- 混合物に65℃のヒートブロックで加熱する。一度加熱し、ヒートブロックをオフにし、徐冷が適切にオリゴヌクレオチドをアニールすることができます。
- 混合物にT4 DNAリガーゼを追加し、2時間室温でインキュベートする。 T4 DNAリガーゼは、オリゴヌクレオチドおよびB、およびλのDNAの接合正しいを触媒する。
- 最後に、T4 DNAリガーゼ緩衝液中のlのDNAに対するオリゴヌクレオチドのDの100倍過剰を追加することにより、DNA複製の鋳型にオリゴヌクレオチドDをアニール。
- ° Cで30ヒートブロックの分、そして室温まで冷却するための徐々にヒートブロックをオフにすることで、45混合物をインキュベートする。
- 最終的なDNA複製のテンプレートが使用できるようになりました。我々は4で1.4 nMの濃度でテンプレートを保存° Cを数週間。
2。ビーズ
ビーズは、ジゴキシゲニンに対する特異性を持つFabフラグメントで官能化される。彼らはその後、DNA複製のテンプレート2に取り付けることができます。
材料：トシル活性化ビーズ、α-ジゴキシゲニンFabフラグメント、緩衝液：0.1 M H3BO3 pH9.5の、緩衝液B：0.1MのPBS pH7.4の、0.1％w / vのBSA、バッファーC：0.2MのTris - HCl pH 8.5の（25 °をC）、0.1％（w / v）のBSA、磁気分離、ローテータ。
- ビーズのストック溶液を再懸濁し、エッペンドルフチューブに小アリコートを移す。解決策が透明になるまで磁気分離とインキュベートのスロットにチューブを挿入後、ピペッティングにより上清を取り除く。
- 抗体の結合のためのトシル基を活性化となる、バッファに追加します。ピペッティングにより穏やかに混合し、磁気分離装置でバッファを削除します。
- バッファに再びFabフラグメントと再懸ビーズを追加して、よく混ぜ、37℃で使用して回転子を16〜24時間インキュベートする。インキュベーションの後、磁気分離装置を使用して別々のビーズとバッファーを除去する。
- 5分間4℃で、バッファBとインキュベートを追加することで、ビーズを洗浄してください。磁気分離装置を使用してバッファを削除します。回洗浄を繰り返します。
- フリートシル基をブロックするために4時間37バッファCとインキュベート° Cを追加。磁気分離装置とバッファを削除を使用して別々のビーズ。
- 使用するための緩衝液Bと分量で2回洗浄する。ビーズは4℃で保存することができます° Cでの実質的な品質の損失（私達の原液は1が含まれている- 2 × 10 9ビーズ/ ml）をせずに1年以上。
3。官能化されたカバーグラス
ガラスのカバースリップにDNAの添付ファイルを許可するには、ガラスはまずビオチン化PEGの分子に結合されたアミノシラン、で官能れる。このコーティングは、表面3,4とDNAと複製タンパク質の非特異的な相互作用を低減することができます。
材料：ガラスのカバーガラス、染色瓶、3 -アミノプロピルトリエトキシシラン、メトキシPEG5k - NHSエステル、ビオチン- PEG5k - NHSester、アセトン、1M KOH、エタノール、オーブン、バス音波処理
- jarファイルを染色し、エタノールで瓶を充填に配置することにより、ガラス製カバースリップを徹底的に清掃してください。瓶を洗浄し、1 M KOHで埋め、30分間超音波洗浄器にかけます。両方の洗浄を繰り返します。
- 第一機能化反応の場合は、水のすべての痕跡を削除する必要があります。 10分間アセトンと超音波処理してjarを埋める。空にし、アセトンで再入力してください。
- アセトンでシラン試薬の2％v / v溶液を準備します。染色瓶に追加し、2分間振とうする。この反応は、カップルガラスにアミノシランのアルコキシ基を、次のカップリングステップの反応性アミンを残して。水の大過剰の反応をクエンチ。
- 110でそれらを焼成することによりカバースリップを乾かします°、30分間オーブンでC。
- 100mMのNaHCO 3で pHを8.2にビオチンPEGの混合物：50:1メトキシを準備します。約0.2％w / vのビオチン化PEGを目指す。
- 乾燥したシラン化カバースリップと場所の上に別のカバースリップ上にPEG混合物の100μL添加します。ガラスのカバースリップのスペーサーを含めると、カバースリップの分離が可能になります。
- 3時間のPEG溶液中でカバーグラスをインキュベートし、カバーガラスの各ペアを分離し、水で広範囲に洗ってください。一度だけの側として側を上に官能カバースリップがPEGでコーティングされるように十分注意してください。
- デシケーター中で真空下で空気と店舗でカバーグラスを乾燥させます。表面は、少なくとも月には安定なので、カバースリップの数十はバッチで行われ、必要に応じて使用することができます。
4。フローチャンバーの準備
実験は、官能カバー、両面テープ、石英スライドとチューブで構成されたシンプルなフローチャンバーを使用して実行されます。つのフローチャンバーは、それぞれの単一分子実験2,4のために準備されます。
材料：両面テープ、カミソリの刃、チューブ、速乾エポキシ樹脂用の穴を持つ石英スライド、官能カバー、ストレプトアビジン溶液（PBS中の1 mg / mLの25μL）、チューブ、ブロッキングバッファー（5X：20mMトリスpHは7.5、2mMのEDTA、50mMのNaCl、0.2 mg / mLのBSA、0.005％のTween - 20）、作業バッファ（1X：20mMトリス- HCl pH7.5の、2mMのEDTA、50mMのNaCl）。
- ブロッキングバッファーと後の手順のために気泡を除去するデシケーター中でバッファの作業を20mlの5 mLを混合して配置することによって開始します。
- 表面上のPBSに希釈したストレプトアビジン液のPEG -官能化されたカバースリップと広がり125を取る。ストレプトアビジンは、表面のビオチンを結合させること、チャンバーの他の部分を準備しながら室温で20分間インキュベートするために、このままにしておきます。
- 石英スライドのサイズに合わせて、両面テープの部分をカット。フローチャンバーのアウトラインがテープ上に描画できるようにテープでチューブの穴の位置をマークします。
- 3mmの幅の中央のチャネルとの両方の穴を含む長方形を作る。我々は2つの吸気口二口Y字型のチャンネルフローチャンバーを使用してください。
- チャンネルに無接着剤突出していることを確認してまっすぐ、きれいな削減を行って、描かれた輪郭に沿ってカット。
- 徹底的に前のフローセルの構造から接着剤を除去するためアセトンまたはエタノールを用いて石英を清掃してください。
- チャンネルの概略の最高のアラインメントを見つける、粘着の片側を取り外し、慎重に石英スライドの上にテープを配置。入口と出口の穴がブロック解除を維持する必要があるとして、適切にテープを揃えるように注意してください。
- フローセルの入口と出口のためにチューブの長さをカット。それは、チューブがチャンバーの底部に対して平らに押ししないように約30 °の角度でチューブの端をカットするのに役立ちます。次のステップでフローセルに簡単に添付ファイルのためにそれらを一時停止するためのサポート（例えば、チューブのラック）のいくつかの並べ替えにチューブを置きます。
- 水で十分ストレプトアビジンでコートしたカバースリップをリンスし、圧縮空気を用いて乾燥させる。片側だけが官能されることに注意してください。テープの裏の反対側を外し、カバーグラスの上に石英スライドを配置。
- 軽く接着剤に閉じ込められた空気を押し出すためにカバースリップを押してください。これは、流路に入る気泡を防ぐことができます。
- エポキシ樹脂とチャンバーの両側をシール。エポキシ樹脂と場所の石英とシールの穴にカットチューブを挿入します。これには数分間乾燥させる必要があります。
- 一度乾燥、真空管のいずれかを使用して脱気ブロッキングバッファーの一部を引っ張って表面をブロッキングを開始。 21ゲージの針は0.76 mmのチューブの内部に完全に適合しています。気泡を除去するために数回はフラッシングを行ってください、とチャンバーは少なくとも半時間インキュベートすることができます。
5。単一分子の複製実験
一旦DNAテンプレートとの官能ビーズを調製し、そしてフローチャンバーの準備ができて、単一分子の実験を行うことができます。
材料：準備されたフローチャンバー、ブロッキングバッファー（5X：20mMトリス- HCl pH7.5の、2mMのEDTA、50mMのNaCl、1 mg / mLのBSA、0.025％のTween - 20）、ワーキングバッファー（1X：20mMのTris - HCl 40mMトリス-塩酸pH7.5、50mMのK -グルタミン酸、2mMのEDTA、100μg/ mlのBSA、10 mMの：10mMのMgCl 2の （1Xの有無液pH7.5、2mMのEDTA、50mMのNaCl）、T7の複製バッファDTT、600μMのdNTP）、複製タンパク質、10X目的、CCDカメラ、恒久的な希土類磁石、シリンジポンプ、airspring、ファイバー照明器、画像収集ソフトウエアを搭載したコンピュータで倒立型光学顕微鏡。
- フローセルがブロックされた後、それは実験を開始する準備ができています。
- フローセルを取ると、顕微鏡のステージ上に置きます。ステージのクリップのある場所でチャンバーを保持すると流路がCCDカメラとの位置合わせに配置されていることを確認してください。
- より大きな直径のコネクタチューブや注射針を使用してairspringするフローセルのアウトレットチューブを接続します。 airspringは、任意のフローの不規則性を安定させるために使用されます。 50 mlのプラスチックチューブは水の45ミリリットルで満たされている。チューブの蓋は、エポキシ樹脂で封止されている。三つの穴は、蓋に穴を開けている、とチューブの3枚はチューブに挿入されます。エポキシを使用して、チューブは、次のように入力したり、エスケープからの空気を防ぐ、蓋に密封されています。 airspringは、シリンジポンプに、とフローセルの出口管に接続されています。
- ブロッキング緩衝液でフローセルのインレットチューブをセットし、チューブ内の空気を除去するために注射器を後方に引いて。出口管の穏やかな映画は、フローセル内に閉じ込められた気泡をクリアするのに役立ちます。
- 一度にすべての気泡が除去されている、針とインレットチューブの1本、1800で、それが曲がったり、粘着テープでチューブを固定することにより出口チューブのいずれかをブロックする。
- 脱気ブロッキング緩衝液1mlに10 PMに株式のDNA鋳型を希釈する。 DNAの良好な表面被覆率を（20分間0.01〜0.05ミリリットル/分がうまく機能）できるように、中程度の流量でチャンバーに流入。これは、カバースリップまたはどのように多くの実験のために望まれているのバッチごとに表面にどのように多くのDNA分子に基づいて変化させることができる。
- 脱気、ブロッキング緩衝液1mlで2 - 4 × 10 6ビーズ/ mlまでストックビーズ溶液を希釈する。 15分間0.01〜0.05ミリリットル/ minでチャンバーに流入。
- 一度ビーズが追加されて、流れをオフにし、チャンバーが平衡に到達することができます。その後、両方のアウトレットチューブを閉じます。密閉チャンバーのないチューブへの変更は、ビーズとせん断つながれたDNA分子上に強い力を発揮する圧力変動の原因となります。
- 針でビーズをロードするために使用された入口管をブロックし、作業バッファのブロッキングバッファーの脱気1X溶液と第2の入口を使用して、フローセルの洗浄を開始。 0.01〜0.05ミリリットル/分の速度で広範囲に洗ってください。非特異的に表面（に付着どんなビーズを除去するためにタップして手動でステージに撹拌タッピング ）。
- 無料のビーズが十分に除去されると、フローをオフにして、チャンバーが平衡に到達することができます。オープン出口管を閉じて、タンパク質溶液に入口の貯水池を切り替えて、徐々に急激な圧力変化を避けるためにコンセントを開く
- ビーズは、流れの方向（変更することによりDNAにつながれているかどうかをチェックできますDNAを ）。
- 今、酵素反応を行うことができます。リーディング鎖の合成の実験のためにGP4ヘリカーゼおよびMgCl 2が含まれていない脱気T7レプリケーションバッファのGP5ポリメラーゼ（そのprocessivity因子チオレドキシンとの複合体として精製された）の20nmの解の20nmのソリューションとなります。
- DNAへの効率的な結合を可能にするために適度な流量でチャンバにタンパク質溶液を流し込む。我々は、8分間0.037ミリリットル/分を使用し、0.012ミリリットル/ 7分間分。
- 無料のタンパク質を除去するためにMgCl 2をせずに脱気したT7の複製バッファーでチャンバーを洗浄する。 30〜10分間0.037ミリリットル/分の速度で正常に動作します。
- 洗浄後、フローT7複製MgCl 2でバッファし、データ収集を開始します。このプロトコールに記載した条件下でDNAのテザーで3 PNの抵抗力に相当する0.012ミリリットル/分の流量を使用してください。
- ビーズと表面との間の非特異的相互作用を防止するためにイメージを作成する前に、フローセル上記希土類永久磁石を配置。
- 10X目的とCCDカメラを使用してフィールドを表示します。テザービーズを使用してフォーカス。
- 10度と顕微鏡の近くに顕微鏡のステージに平行との間の入射角で光ファイバ照明器を置きます。暗視野照明は、ビーズの画像のコントラストを高めるために使用されます。
- 遅いフレームレート（通常は2から4 Hz）で20 30分間のデータを取得する。
6。代表的な結果
成功した実験では（同時に100以上のビーズを観察することができるはずリーディング鎖の合成 ）。実験では、リーディング鎖のDNA合成を表示する多数のトレースを生成する必要があります。
データ解析：
DNA巻き戻しと重合率とprocessivitiesを測定するために、ビーズの正確な位置が決定されている必要があります。あなたは2次元のガウス関数でこれらの位置を適合させることによりそれを達成することができます。軌跡は、トラッキングソフトウェア（例えばDiaTrack）を使用して、各フレームでビーズの位置を追跡することによって抽出することができます。これで、ので、任意のグラフィックを使用して、時間の関数としてビーズの位置をプロットすることにより、軌道を視覚化する準備が整いましたftware（例えば原点）。速度のデータを取得するには、線形回帰を使ってプロットをフィットして傾きを計算する。 processivityの場合は、短縮のイベント（図3）開始から終了までのDNAの合計の長さを決定する。これらの数字の両方が塩基対に変換する必要があります。塩基対にビーズの動きを変換するには、まず反応の流量で、ストレッチλのDNA分子の長さを測定する必要があります。 λDNAの長さが（48502 bp）を知られているのでこの実験的な力で塩基対/ピクセルの数を調整することができます。精度を高めるため、興味の痕跡から酵素的に改変されていないビーズテザーのベースライントレースを引きます。すべての単一の測定値とのプロット率とprocessivity分布を組み合わせる。ガウスと単一指数関数、それぞれ（図3）を使って、データを近似します。
図1。単分子実験。 （A）二重λDNAを（48.5 KB）5を介してフローセルの表面に取り付けられています"ビオチン - ストレプトアビジン相互作用を使用して1つの鎖の端、および3'同じ鎖の端は、使用してビーズに接続されているジゴキシゲニン抗ジゴキシゲニン相互作用。下塗り複製フォークはポリメラーゼの読み込みを可能にするためにビーズ反対側の端部に形成されている。 （b）のビーズ- DNAのアセンブリは、バッファの層流を用いて伸ばし、広視野光学顕微鏡を用いて画像化している。一定の延伸力を維持しながら、時間をかけてビーズの位置を追跡することにより、DNA構築物の長さを監視することができます。低力の下に（C）拡張ssDNAのプロフィール（黒丸）とdsDNA（白丸）。破線は、完全にDS -λDNAの結晶長さは16.3ミクロンを示しています。 3 PNの周りの力でssDNAのとdsDNAとの間の長さに大きな違いは、DNAの長さの変化をモニタリングすることによりSS -とdsDNAとの間の変換を直接観察することができます。 DNA結合ビーズの多数の同時可視化は、1回の実験で多くの個々のreplisomesの研究が可能になります。
図2バクテリオファージT7の複製タンパク質：DNAポリメラーゼ（GP5とチオレドキシンの複合体）とDNAヘリカーゼ（GP4）は、デオキシリボヌクレオチドとマグネシウムの存在下でDNAリーディング鎖を合成する。このプロセスは、巻取りによるDNAラギング鎖の短縮を伴っている。ビーズのssDNAの位置を変えるにdsDNAの変換。ビーズの位置を測定することはDNA複製の速度とprocessivityの正確な測定が可能になります。
図3。単分子リーディング鎖の合成の実験から代表的なデータの例。 DNA複製のProcessivityは短縮イベントの始めから終わりまでのDNAの長さの合計に等しくなります。 DNA複製の速度は、直線回帰でプロットをフィットして傾きを計算することによって得られる。測定値の数からデータを組み合わせることによって得られたはめ込みショーの速度とprocessivity分布。データは、それぞれ、ガウスと単一指数関数を用いてフィットした。
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Discussion
層流でビーズに加わる抗力は、複製タンパク質の酵素活性に影響を与えないことを保証することが重要です。例えば、0.012 ml / minの流量に対応する3 PNの力は、DNAリーディング鎖の複製には影響しません。しかしそれは協調DNA合成中に行われる酵素活性に影響を与えます、そして、従って、1.5 PNに縮小する必要があります。抗力は、簡単に流量や流路5の幅を変更することによって制御できます。
DNA伸長アッセイは、二重と一本鎖DNAとの間の長さの違いを採用しています。実験では、ssDNAのへのdsDNAの変換は、リーディング鎖の合成（図2）の結果として発生するここで説明する。 ssDNAは6 PN（図1）以下の低伸縮力でのみdsDNAをより短いことを覚えておく必要があります。
この方法の可能な改善は、その3'末端に2番目のビーズを取り付けることにより、レプリケーションテンプレートのラギング鎖を変更することです。このような交代は、DNAの両鎖で行わ酵素活性の直接観察を可能にするであろう。
リーディング鎖の合成と協調複製の研究から離れて、DNA伸長アッセイが正常に単一分子λエキソヌクレアーゼの動態、およびレプリケーション5,6の間にポリメラーゼの交換のダイナミクスを調べるために用いられてきた。原則として、このメソッドは任意のDNAのプロセシング酵素を研究するために使用することができます。
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Acknowledgments
DNA伸長アッセイの開発はポールBlainey、ジョン鳳リー、とSamirハムダンによって助けられた。この作品は、チャールズリチャードソン（GM54397）、およびアントワーヌバンOijen（GM077248）に健康補助金の国立研究所によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | |
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| α-digoxigenin Fab | Roche Group | 11214667001 | |
| Tosyl Activated Beads | Invitrogen | 142-03 | |
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | |
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | |
| Double-sided tape | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | 100 μm thickness |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus Corporation | Olympus IX-51 | |
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | |
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
References
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- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
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