Summary
استخراج البروتين لتحليل البروتين في الأنواع الفطرية تتطلب مستويات عالية من التوحيد القياسي لإنجازها وفقا مع الحد الأدنى من المعلومات عن التجربة البروتين (MIAPE) المبادئ التوجيهية. نقدم الفيديو البروتوكول الذي يتضمن إجراء لتقليل التحيز التجريبية خلال تحريض واستخراج السموم من البروتين
Abstract
Fusaria والفطريات الخيطية قادرة على انتاج سموم مختلفة. السموم الفطرية مثل فيوزاريوم deoxynivalenol ، nivalenol ، T2 ، zearelenone ، fusaric حامض ، moniliformin ، الخ... لها آثار ضارة على صحة الإنسان والحيوان على حد سواء ، وتعتبر بعض العوامل المرضية و. وأظهرت دراسات البروتين أن تكون فعالة لآليات فك رموز إنتاج توكسين (تايلور وآخرون ، 2008) فضلا عن تحديد العوامل المسببة المحتملة (ورقة وآخرون ، 2007 ، Houterman وآخرون ، 2007) في Fusaria. لذا يصبح من الأساسي لتأسيس وسائل موثوق بها لمقارنة بين الدراسات البروتين من أجل الاعتماد على الاختلافات الحقيقية موجودة في تعبير البروتين بين التجارب وسلالات والمختبرات. وينبغي أن الإجراء الذي سيتم وصفه تساهم في زيادة مستوى البروتين توحيد الإجراءات من قبل اثنين من الطرق. يتم استخدام بروتوكول تصويره لزيادة مستوى التفاصيل التي يمكن وصفها بدقة. وعلاوة على ذلك ، وتوافر إجراءات موحدة لعملية بيولوجية يعيد ينبغي ضمان متانة أعلى من البيانات ، مع الأخذ في الاعتبار أيضا عامل استنساخ الإنسان داخل الإجراء التقني للاستخراج.
وصف البروتوكول يتطلب 16 يوما للانتهاء منه : أربعة عشر يوما للثقافات ويومين لاستخراج البروتين (الشكل 1).
لفترة وجيزة ، وتزرع سلالات فيوزاريوم على وسائل الاعلام الصلبة لمدة 4 أيام ، ويتم بعد ذلك مجزأة يدويا ونقل الى وسائل الاعلام إحداث تعديل توكسين (جياو وآخرون ، 2008) لمدة 10 يوما. يتم جمعها عن طريق الترشيح من خلال أفطورة طبقة Miracloth. يتم تنفيذ طاحنة في غرفة باردة. شركات مختلفة تقوم استخراج نسخ متماثلة (ن = 3) من أجل أن تأخذ في الاعتبار تحيز بسبب اختلاف التقنية (الشكل 2). واستند على استخراج العازلة SDS / DTT كما هو موضح في تايلور وآخرون. (2008) مع تعديلات طفيفة. مطلوب استخراج البروتين الكلي عملية ترسيب البروتينات باستخدام Aceton / TCA / DTT غسل العازلة بين عشية وضحاها والأسيتون / DTT (الشكل 3A ، 3B). وأخيرا resolubilized البروتينات في المنطقة العازلة بروتين وضع العلامات وكميا. وكانت نتائج استخراج تصور على هلام 1D (الشكل 4 ، SDS - PAGE) ، قبل الشروع في المواد الهلامية 2D (IEF / SDS - PAGE). ويمكن تطبيق نفس الإجراء على غيرها من البروتين تحليلات وسائل الإعلام وتزايد الفطريات الخيطية الأخرى (مايلز وآخرون ، 2007).
Protocol
البروتوكول يتطلب 16 يوما لاستكماله. الإطار الزمني هو مفصل في الشكل 1.
تفاصيل لإعداد العازلة
- التحضير للتحلل العازلة (3mL لكل عينة).
- إعداد العازلة الغسيل (50mL لكل عينة). وينبغي أن يكون هذا المخزن قبل المبردة وتخزينها على -20 درجة مئوية في الثلاجة حتى إجراء مزيد من التحليل ويحرص على الجليد خلال الإجراء بأكمله.
- إعداد العازلة هطول الأمطار (20mL لكل عينة). وينبغي أن يكون هذا المخزن قبل المبردة وتخزينها على -20 درجة مئوية في الثلاجة لحين الحاجة إليها ويحرص على الجليد خلال الإجراء بأكمله.
- وينبغي العمل بشكل تفضيلي ستنفذ في الغرفة الباردة عند 4 درجات مئوية.
الأنواع الفطرية
صنفت ثلاث سلالات تستخدم لتحليل البروتين أن يكون فيوزاريوم graminearum على أساس خصائصها الشكلية والترجمة ، الاستطالة ألفا - 1 عامل التحليل (أودونيل وآخرون ، 1998)
تنتمي هذه السلالات لجمع يبمان - CRP جبريل وكان مسك وتخزينها في -- 80 درجة مئوية في 15 ٪ الجلسرين.
إعداد فطر
تم الانتهاء من زراعة الفطريات على V8 لمدة 4 أيام في درجة حرارة 25 مئوية بالتناوب فترة الضوء والظلام في كل ساعة 12. وكانت مجزأة الثقافات باستخدام شفرة معقمة وقطعة من هذه الثقافات كانت تستخدم لتطعيم 250 مل تحتوي على قوارير مخروطي سعة 100 مل من السم الذي يحفز وسائل الإعلام. كانت تحصد فطر بعد 10 أيام وفصلوا عن المتوسط عن طريق تصفية الثقافة مع مرشح العقيمة. وجرفت المياه فطر 3 مرات مع الماء المعقم لإزالة بقايا والمتوسطة وغيرها من المركبات. ونحن على الفور ثم جمدت الخلايا بإضافة النيتروجين السائل وحافظت على عينات من -80 درجة مئوية.
الوصف العام للاستخراج البروتين
تم استخراج عينات من البروتين باستخدام الأسلوب هو موضح في الشكل 3A و 3B. كانت الأرض عينات فيوزاريوم في النيتروجين السائل والمسحوق وجمعت في 10 مل أنابيب تفلون. وكانت العينات المحتضنة ثم 30 دقيقة مع تحلل العازلة ، المغلي لمدة 10 دقائق ، وطرد 2 مرات في درجة حرارة الغرفة (12000g لمدة 15 دقيقة). تم جمع supernatants والمحتضنة في -20 درجة مئوية مع هطول الأمطار العازلة بين عشية وضحاها. بعد الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة 30000g ، تم غسلها الكريات من البروتينات عجلت 3 مرات مع الأسيتون الباردة التي تحتوي على DTT. أخيرا ، كانت كريات الهواء المجفف وكانت resolubilized البروتينات الموجودة في المخزن المؤقت وضع العلامات ، وتعديل درجة الحموضة إلى 8. تمت إزالة عينة فرعية مؤلفة من 30 مل لتقدير البروتين الكلي وتخزين طاف المتبقية في -20 درجة مئوية حتى رحلان البروتين.
الشكل 1. الجدول الزمني لهذا الإجراء.
الشكل 2. مخطط لشركات متعددة تجهيز العينة.
3A الرقم. 
3B الرقم. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 3A ، أو هنا لنسخة أكبر من 3B الرقم.
الأرقام - 3A ب مخططات انسيابية لاستخراج البروتين الداخلي (A : اليوم الأول ؛ B : اليوم الثاني).
الشكل 4. صورة 1D مقتطفات من البروتين. تم تشغيل البروتينات حتى الهجرة كاملة من اللون الأزرق إلى نهاية الجل الذي ملطخة بيربل الحمم البركانية. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 4.
Discussion
الاهتمام مؤخرا في النهج البروتين داخل نطاق الأحياء الفطرية أدى إلى زيادة عدد المطبوعات باستخدام هذه التقنية (كما هو الحال في استعراض كيم وآخرون ، 2007). طرق لاستخراج البروتين تعتمد على مزيج من إجراءات استخراج ؛ غالبا ما وصفوه بصعوبة في المقاطع المنهجية وتتطلب خبرة في التعامل مع أساليب المشاكل المحتملة.
كما لغيرها من النهج "omics" ، ووضع معايير لتجهيز العينات والبيانات الضرورية من أجل توليد معلومات علمية موثوقة. وعلاوة على ذلك ينبغي أن تكون العينات وإجراءات التلاعب صفها على نحو كاف من أجل السماح للتفسير مشترك بين مختلف التجارب نتيجة "omics". سيكون هذا أمرا أساسيا لاستغلال كامل امكانيات عبر البيانات التعدين في الجينوميات ، البروتيوميات ، metabolomics... (موريسون وآخرون ، 2006). وقد تمت صياغة الحد الأدنى من المعلومات عن تجربة والبروتين قد تم تشكيل مجموعة عمل من أجل التصدي لجميع جوانب تجربة (جل الكهربائي ، مطياف الكتلة ، التفاعلات الجزيئية ، تعديلات البروتين ، البروتيوميات المعلوماتية وتجهيز عينة). في هذه اللحظة توجد معلومات محددة متاحة بشأن إجراءات تجهيز العينات. نظرا لأهمية إجراءات استخراج البروتين في تحديد نوعية البروتين النهائي من الدراسات ، من أجل تنفيذ الإجراءات التي يمكن أن تزيد التوحيد في إطار المبادئ التوجيهية MIAPE (تايلور وآخرون ، 2007) ، واقترحنا استخدام بروتوكول الفيديو بالتفصيل العينة التجهيز. وقد وصف الفيديو من التجارب تساهم بقدر كبير في زيادة عدد المعلومات عن تجهيز العينات التي قد تؤدي إلى أفضل استنساخ التجارب "omics" (باسكوالي ، 2007).
في الواقع ، عبر استنساخ المختبرات هو شرط أساسي من أجل ضمان صحة نتائج البروتيوميات (http://www.fixingproteomics.org). يتأثر استنساخ عبر المختبر من قبل اثنين من العوامل : أدوات القياس المختلفة ، ومختلف العاملين التلاعب العينات.
في البروتوكول وصفها ، فإننا نقترح على أداء البيولوجية يتطابق تضم مشغلي متعددة (الشكل 2 والفيديو) لزيادة موثوقية من البيانات (يتم اتخاذ أي تباين النتائج الفنية للفي الاعتبار).
ويستند الإجراء الموضح لاستخراج البروتين في SDS والتدفئة. سبق ان عرضه هذا لضمان نقاء وكمية جيدة من البروتينات (جسر 1996). SDS مقرونا الغليان يذوب جدران الخلايا والبروتينات مسعور ويمنع تشكيل oligomers الأمطار التي تسقط من البروتينات. الغليان كما يسمح لتعطيل البروتياز. ويتم إنتاج نفس التأثير أيضا EDTA ، واستكمال PMSF مثبط البروتياز مصغرة. DTT يزيل الجسور في ثاني كبريتيد بين البروتينات وتيسير solubilization البروتين.
من أجل إزالة SDS IEF قبل ، هي التي عجلت البروتينات الأسيتون / TCA / DTT. وعلاوة على ذلك ، والأسيتون / TCA / DTT الأمطار يسمح إزالة بعض الملوثات مثل الدهون والأحماض النووية ، وأملاح و / أو مركبات الفينول عند هذه المركبات موجودة. مثل الحزب الديمقراطي الصربي ، وهذه الجزيئات منع الهجرة جيدة خلال منتدى الطاقة الدولي. بعد هذا التساقط ، فمن الضروري أن يغسل البروتينات التي عجلت الأسيتون / DTT ، من أجل إزالة TCA لأنها يمكن أن تتداخل مع منتدى الطاقة الدولي.
وإعداد نموذج جيد هو المفتاح لتحقيق نتائج جيدة. لهذا ، فإنه من الضروري أيضا تجنب تلوث البيئة البروتينات من العمل مع القفازات مسحوق الحرة واحترام الممارسات المختبرية الجيدة. من الناحية التقنية ، في إطار البروتوكول وصفها ، من أهم الخطوات للحصول على كميات كافية من البروتينات والنقاء وعلى مرحلتين. الأولى ، مرحلة طحن حيث التدمير الكامل للالخلية الأساسية للافراج عن البروتينات ، والثانية ، وتنقية البروتينات الكلية ، وهي المرحلة التي تشمل ازالة الغالبية العظمى من الحمض النووي ، والدهون وغيرها من الملوثات التي قد تتداخل مع الهجرة من البروتينات.
Acknowledgments
نشكر Servane Contal وUntereiner بوريس لمساهمتهم الفنية. نعترف دعم FNR مشروع "FUTOX".
Materials
Media and solutions PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water. Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water. Lysis Buffer:
Precipitation Buffer:
Washing Buffer:
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Bridge, P. Protein Extraction from Fungi. Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).
- Jiao, F. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).
- Kim, Y. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).
- Milles, J. Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds. Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).
- Morrison, N., Field, D. Concept of sample in OMICS technology. OMICS. 10, 127-137 (2006).
- O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. PNAS. 95, 2044-2049 (1998).
- Paper, J. M. Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum. Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).
- Pasquali, M. Video in science. Protocol videos: the implications for research and society. EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).
- Taylor, C. F. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).
- Taylor, R. D. Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions. Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).
